人乳头状瘤病毒的精准检测与宫颈癌防治

原亚莉，贺桂芳，卞美璐

（1.北京大学医学部，北京 100191；2.中日友好医院 妇产科，北京 100029）

综述

人乳头状瘤病毒的精准检测与宫颈癌防治

原亚莉1，贺桂芳2⋆，卞美璐2

（1.北京大学医学部，北京 100191；2.中日友好医院 妇产科，北京 100029）

子宫颈癌是世界上最常见的妇科恶性肿瘤之一，在女性所有肿瘤中居第二位。在发达国家，由于定期的巴氏筛查试验和疫苗接种，发病率下降，但是在发展中国家（包括亚洲），死亡率仍达80%[1]。高危型人乳头状瘤病毒（highrisk human papillomavirus，HR-HPV）的感染与宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的发生和发展密切相关。E6、E7基因是HPV的主要致癌基因，在大多数情况下，当HPV病毒的DNA插入人类基因组时，会触发宫颈癌发病机理，导致E6、E7基因表达失调，使肿瘤抑制基因失活和癌基因激活，细胞不断增殖而失去修复损伤的能力，进而导致癌症的发生[2]，而一过性感染不一定致癌。目前人们广泛应用HPV-DNA检测来筛查宫颈高级别病变[3，4]，但是HPV DNA检测并不能区分一过性感染和真正可能发展为癌的人群。因此HPV E6/E7mRNA检测引起了很多学者的关注，它作为受感染细胞中E6/E7癌基因持续表达的标志，可能提示了病毒的活性和病变的进展程度[5]。

1 HPV检测

HPV的基因组是一个圆形的DNA双链约8 kb，主要分为3个区域包括8个早期开放读码框架 （E1-E8）、2个晚期读码框架（L1，L2）和1个非编码长控区。早期（E）区和长控区用于编码病毒基因表达、复制和存活的蛋白，而晚期（L）区用于编码病毒结构蛋白。E5是第一个由HPV编码的与各种跨膜蛋白高度相互作用的癌蛋白。E6基因编码的E6蛋白与P53结合，影响细胞内的多条信号途径，从而影响细胞周期。E7基因编码的E7蛋白主要结合Rb蛋白，使静止的G0期细胞进入细胞周期，与E6蛋白协同作用导致细胞发生永生化。

Stoler等[6]进行了一项大型的子宫颈癌筛查临床研究（47208例妇女参与、持续5年）发现，细胞学检查漏诊的高级别上皮内瘤变中，有l／3为HPVl6型和（或）HPVl8型阳性。细胞学检查阴性但HPV16、18型阳性的妇女，发生CIN II及以上病变的风险分别为13.6%、7%。也有学者探讨了HPV基因分型试验结果，其中HPV-16和18联合引起宫颈癌病例的80.79%[7]。因此，在HPV所有亚型中，16、18亚型是最常见的HPV致癌亚型[8]。全世界约70%宫颈癌是由HPV16、18亚型引起[9]。2013年ASCCP（美国阴道镜检查与宫颈病理学会）新版指南提出HPV16或18型阳性的，直接行阴道镜检查。提示在宫颈癌筛查中，检测HPV病毒16、18分型可达到更精准的检测，指导精准治疗。

1.1 HPV DNA检测

1.1.1 基于宫颈样本的检测

目前针对高危HPV病毒检测最常用的是荧光定量PCR（如罗氏cobas 4800）和HC2-HPV-DNA。HC2-HPVDNA检测是通过使用特异的RNA探针进行HPV定量检测，但不能进行HPV分型。罗氏HPV-DNA检测是美国FDA于2011年认证的针对HPV L1区域的荧光定量PCR检测，能够进行16、18等分型。有一项研究评估了2种检测HR-HPV的实时PCR测定（雅培RealTime HR-HPV和罗氏Cobas HPV）与HC2相比的临床表现。在总共356个宫颈拭子样品中，雅培（Abbott）和罗氏 HPV测定与HC2的一致率分别为86.1%和89.9%。HC2在检测HR-HPV方面的灵敏度和特异性分别为96.6%和89.1%，而Abbott为78.3%和99.2%，罗氏为91.7%和97.0%[10]。总之，虽然这2种方法在检测HR-HPV方面的灵敏度低于HC2，但是这些测定法能提供HPV特异性基因型，因而有一定临床应用价值。

HPV DNA检测可以帮助筛选宫颈癌的高危人群。HPV DNA分型检测能对6种低危型（6、11、42、43、44、81）和 15种高危型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68）进行检测。其意义在于，低危型HPV感染多数引起良性病变，能自行消退，但易反复发作，如6、11型易引起尖锐湿疣等。高危型HPV感染是造成女性宫颈癌的重要原因，需结合TCT（液基细胞学技术）等其他证据，决定是否需要进一步治疗。Sohrabi等[11]证明，HPV在各中心感染型别分布两头很稳定，中间型别感染率差别不大：前3位的高危感染型别是16、52、58，最后2位是26、45。前3位的低危感染型别是81、61、43，最后2位是40、83。总之，保持在第1位的始终是16型，而20～39岁/40～59岁年龄组52型高于58型，60岁以上年龄组58型略高于52型。在第十五次全国子宫颈癌协作会议上有专家建议对HPV 16/18/52/58阳性者均立即行阴道镜检查，但仍需一定的实验数据来支持。

1.1.2 基于尿液样本的HPV检测

基于宫颈样本的HPV检测对宫颈癌筛查有重要意义。然而，宫颈取样是侵入性的。因此，有必要研究一种更方便快捷的方法用于检测HPV，如尿液样本。Lim等[12]在国家癌症中心通过100组宫颈和尿液样本进行HPV DNA检测。结果显示，使用尿液样本检测任何高危HPV类型时，不同HPV DNA检测方法之间的总体是一致的，并且几乎可以完全检测出HPV 16/18型（99.0%）。然而，使用尿样的HPV DNA检测比使用宫颈样品的HPV DNA检测检出率低。但在特定条件下，使用尿样的HPV DNA检测显示出与使用宫颈样品相当的高灵敏度和特异性。如果使用全自动DNA提取和检测系统，可以减少HPV检测的变异性，并加速尿液中HPV检测的标准化。因此，尿液样品在未来有可能成为一个有效的替代品。

1.2 HPV E6/E7mRNA检测

鉴于90%高危型HPV感染为一过性感染，不一定导致宫颈癌，使得HPV DNA检测存在一定的假阳性率，在临床上可能会导致过度治疗。此外，HPV DNA检测是基于病毒L1区域设计探针的，存在一定的假阴性率。在DNA整合过程中，L1区有时会缺失而E6/E7区一直稳定存在。可知，高危型HPV病毒DNA存在，不一定会导致细胞发生癌变；而E6/E7mRNA是病毒基因整合入人体并表达的标志，能更准确的筛查出可能发展为高级别宫颈病变的人群，有效降低对一过性感染的检出率和过度治疗，且不漏诊，使患者潜在风险最小化，有可能成为宫颈癌筛查较理想的筛查策略。

近几年多项研究表明，在非典型鳞状细胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）患者中，HPV E6/E7mRNA相比HPV DNA在检测高级别宫颈病变方面显示出更高的特异性和阳性预测值，显著减少了阴道镜转诊率，意味着它在ASCUS分流管理中是一个有前途的技术方式。Li等[13]研究了591例ASCUS患者接受HPV DNA筛查得出，E6/E7 mRNA在检测高级别宫颈上皮内瘤变方面的灵敏度与HPV DNA检测的灵敏度相似，特异性较高。Zhao等[14]研究显示，HR-HPV E6/E7 mRNA阳性率在CIN 1中为38.6%，在CIN 2～3中为77.4%，在鳞癌中为92.5%。HPV E6/E7mRNA随着宫颈的病变严重程度增加而增加，且在高级别病变中显示出比HC-2和HPV DNA测试更高的特异性（61.4%，54.3%，55.7%）和更高的阳性预测值（75.9%，74.8%，74.6%）。低级别宫颈上皮内瘤变有可逆性，高级别宫颈上皮内瘤变与发展为浸润型癌有关，而HPV E6/E7mRNA阳性的患者更有可能发展为高级别宫颈上皮内瘤变。Tüney等[15]进行了一项评估81例异常细胞学妇女的HPV mRNA和DNA检测。HPV DNA的检出率为90.1%，HPV E6/E7mRNA为55.6%。在随访期间对25例进行活检，均检测到HPV DNA，HPV E6/E7表达仅存在于CINⅠ-Ⅲ患者中。因此，E6/E7mRNA测试相比DNA测试，能更好预测宫颈病变的进展。mRNA阳性妇女向CIN2和更高等级发展的风险高于mRNA阴性妇女[16]。还有研究表明在宫颈锥切术后病灶残留和复发的诊断中，HPV E6/E7 mRNA检测的特异性和阳性预测值均高于HPV-DNA检测[17]，将HPV E6/E7 mRNA检测纳入随访检查内容可及时有效预测宫颈锥切术后CIN残留/复发风险，并能减少过度检查及随访频率。

2 HPV预防与治疗

2.1 HPV疫苗

目前有3种HPV疫苗：二价（抗HPV16、18型）疫苗、四价（抗 HPV6、11、16、18型）疫苗和九价（抗 HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58）疫苗。九价疫苗的保护范围较宽，能预防90%的宫颈癌[18]。2016年美国癌症协会（ACS）推荐的HPV疫苗接种年龄为9～26岁，其中最佳年龄限定为11～12岁儿童，并强调在13周岁之前完成全部接种才能获得最大保护效力[19]。有学者探讨了在年龄＞25岁的女性中（无论是否具有HPV感染病史）接种HPV疫苗的情况，结果表明HPV疫苗可继续预防相关的感染和宫颈病变[20]。

VGX-3100是一种作用于16、18型HPV的E6和E7蛋白治疗性的疫苗，它被设计用来对抗现有的宫颈癌及控制癌前病变。该疫苗通过在患者的细胞内插入一段编码某种特异性蛋白的DNA而发挥作用，其作用方式类似于基因疗法。在接种VGX-3100后能诱发产生可摧毁癌症的被称作CD8+T细胞的免疫细胞[21]。Bagarazzi等[22]进行的临床试验显示：VGX-3100是一种有效的对抗 HPV-16和HPV-18相关的CIN2/3的治疗性疫苗，可能在未来治疗已经感染HPV的患者中发挥作用。

2.2 基因治疗

基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，达到治疗目的。从广义上说，基因治疗包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。马丁等[23]研究设计了HPV致癌基因的分子剪辑技术，能特异性靶向切割HPV E6、E7序列，造成E6、E7基因的框移突变，致使癌基因片段崩解，使宫颈癌前病变恢复正常，从而实现HPV致癌基因敲除的目的。

3 宫颈癌的精准筛查

大多数情况下，当HPV病毒发生持续感染后，病毒基因和人类基因发生整合，E6、E7基因被激活，利用宿主细胞大量转录mRNA、从而导致大量癌蛋白的表达，致使细胞发生高级别病变。宫颈细胞HPV E6/E7mRNA诊断可较大程度降低过度检查和治疗的可能性，诊断高级别宫颈病变的准确性较高，可降低宫颈病变的漏诊率，对于宫颈病变的诊断有较高临床应用价值。Ngo等[24]进行了一项前瞻性多中心欧洲研究，该研究计划招募700个先前未治疗的宫颈癌患者。主要目标是发现主要分子改变、信号途径激活、以及可预测对治疗应答或抵抗的肿瘤微环境模式。这项结果将可能支持临床实践指南的发展，提高宫颈癌患者的预后及生活质量。

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R711.74

A

1001-0025（2017）03-0179-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.03.015

国家自然科学基金（编号81202966）

2* 本文通讯作者。

原亚莉（1991-），女，硕士研究生。

2017-03-27

2017-04-22