基因启动子甲基化作为口腔鳞状细胞癌潜在诊断指标的研究进展

王翰杰，沈佳程，梁俏美，刘 伟（河北医科大学基础医学院，河北医科大学基础医学院免疫学教研室，河北省重大疾病的免疫机制及干预重点实验室，河北石家庄05007）

基因启动子甲基化作为口腔鳞状细胞癌潜在诊断指标的研究进展

王翰杰1，沈佳程1，梁俏美1，刘 伟2（1河北医科大学基础医学院，2河北医科大学基础医学院免疫学教研室，河北省重大疾病的免疫机制及干预重点实验室，河北石家庄050017）

DNA甲基化作为表观遗传学的表现形式之一，在维持细胞功能中起重要作用，是一种用来抑制不必要的基因表达的自然调控机制．基因启动子异常甲基化会导致基因表达下调，一定程度上参与了多种癌症的进程．近年来，大量研究发现，基因启动子甲基化可作为口腔鳞状细胞癌（OSCC）潜在和敏感的生物学标志物，实现其早期诊断和追踪癌症的预后情况．

口腔鳞状细胞癌；表观遗传学；启动子甲基化；生物学标志物

0 引言

在全球范围内，口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是一种普遍且高致死性的癌症［1］，占人群所有恶性肿瘤的3%～5%［2］．调查发现，在发达国家和年轻群体中OSCC的发病率有所上升．虽然针对OSCC的治疗措施在不断地改进，但近二十年内5年生存率仍低于50%［3-4］．根据全球22个肿瘤登记处以及89212例舌部鳞状上皮细胞癌的数据，发现大部分地区每年发病率增长0．4%～3．3%［5］．与此同时，Patel等［6］发现患舌部鳞状上皮细胞癌的年轻人（年龄＜45岁）有上升趋势（年度变化百分比为1．8%；P＜0．05）．OSCC预后较差，掌握口腔肿瘤的分子机制对延长口腔癌症患者的生存年限十分重要．许多研究结果表明，表观遗传学修饰在肿瘤发展过程中起到十分重要的作用［7］．表观遗传可以通过一些不同的形式影响基因的表达，而DNA甲基化（DNA methylation）是表观遗传学的一种重要表现形式，在致癌过程中起重要作用．其中DNA高甲基化主要发生于基因启动子区域的CpG岛，通常诱导基因沉默［8］．

有研究发现有86个基因在OSCC组织和正常组织中存在差异，其中OSCC患者的基因表现为高甲基化［9］．Towle等［10］报导了在口腔肿瘤形成过程中，早期DNA启动子甲基化改变和组织学改变有关．他们证明了这些改变是口腔肿瘤形成的早期事件，为生物标志物发展提供了机会［11］．此外OSCC全基因组甲基化研究表明，整体模式比单个基因甲基化的表观遗传改变能更确切的分辨肿瘤和正常的头部、颈部上皮组织［9］．因此，DNA启动子甲基化分析可能成为OSCC预测、检验以及预后治疗的一种良好工具．与此同时，研究人员已经着手通过血清样本对OSCC患者启动子甲基化进行研究．本研究对近期较新研究的5个OSCC基因启动子甲基化的相关进展进行综述．

1 CMTM5

CMTM （CKLF-like MAREL transmembrane domain-containing family）是一种新的家族蛋白，与趋化因子和四次跨膜蛋白有关，其中CMTM5（CKLF-like MAREL transmembrane domain-containing member 5）是近期研究发现的潜在肿瘤抑制基因，而CMTM5-v1是一种主要的形式［12-13］．CMTM5-v1表达恢复会强烈抑制肿瘤细胞的生长和转移，也会诱导肿瘤细胞系的凋亡［12-13］．近年来，应用实时定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）、甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymer-ase chain reaction，MSP）、亚硫酸氢盐修饰测序法（bisulfite-sequencing polymerase chain reaction，BSP）等方法，证实CMTM5启动子甲基化与肿瘤形成有一定联系［12］．Zhang等［12］研究表明，CMTM5在CAL27和GNM等OSCC细胞系中启动子完全甲基化，在所有口腔癌细胞系中CMTM5的表达量与甲基化的程度有关．研究通过单独应用甲基化转移酶抑制剂（aza）或合用组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑霉素A（T）对细胞系CAL27进行处理，使CMTM5恢复表达，诱导了癌细胞的衰老并抑制其转移［13］．在OSCC组织中，CMTM5蛋白在正常组织中有34例表达较高，占60．71%，癌组织中有4例表达较高，占7．84%．说明CMTM5在正常组织结构中的表达要强于癌组织（P＜0．001）［12］．Zhang等［12］发现CMTM5的表达与OSCC患者的年龄明显相关，且表观遗传的改变发生在较早阶段．CMTM5表达减少或缺乏在年轻患者中更为频繁，这表明CMTM5的沉默可能诱导早期的癌变并在年轻OSCC患者的病理改变中扮演着重要的角色．因此CMTM5甲基化可以作为一种潜在的表观遗传学生物标志，对OSCC患者进行早期诊断．

2 CELSR3

CELSR3属表面粘附分子亚家族、钙黏蛋白超家族，是细胞连接信号转导的成分［8］，WNT／PCP信号通路．该信号通路的异常激活可使组织极性、侵袭、代谢发生改变而引发恶性肿瘤．Khor等［14］的研究中，利用甲基化特异性高分辨率熔解分析（methylation specifichigh resolution melting，MS-HRM）得到样本CELSR3甲基化水平的百分数．在 OSCC石蜡包埋组织中，CELSR3基因甲基化百分数为87．5%（n＝35），因此表明CELSR3在OSCC中呈高甲基化．此外，4例正常黏膜组织样本的CELSR3甲基化水平为0～25%；根据甲基化百分数超过50%作为高甲基化水平的标准，46例癌组织样本中有8例（16%）甲基化水平低，38例（76%）甲基化水平高［8］．这说明CELSR3的高甲基化可能参与口腔肿瘤的形成［8］，因此其可以作为癌症检测中的一个潜在生物学标记．此外，Khor等［8］对OSCC患者的人口统计学参数（年龄、性别、种族）和临床病理参数的（癌症部位、病理分期、淋巴结转移状态）相关性进行分析，结果表明，CELSR3的高甲基化和患者种族（P＝0．005）、年龄（P＝0．024）、病理分期（P＝0．004）在数据上有着明显的联系，提示依据OSCC患者的种族、年龄、病理分期进行管理时，可以将CELSR3高甲基化作为口腔癌预后工具［8］．

3 MGMT

MGMT基因是一种DNA修复基因，其编码DNA修复蛋白AGT，可通过移除鸟嘌呤O6位的加合物来修复潜在的诱变及DNA的细胞毒素性烷化．MGMT基因的下调会导致AGT蛋白形成减少［15］．早期研究已发现，在许多原发性人类癌症中MGMT蛋白质的表达缺失主要和该基因启动子的高甲基化有关［16-20］．因此该DNA修复机制的失活有可能与人类肿瘤的形成有重要联系［21］．Bhatia等［21］对口腔癌前病变组和OSCC组的组织、血液样本中MGMT基因启动子序列甲基化进行分析，得到口腔癌前病变组和OSCC组的组织中该基因甲基化分别为59%和76%，血液样本则为39%和57%，而对照组的组织样本甲基化为13%，血液样本为6%．较对照组而言，口腔癌前病变和OSCC的组织和血液样本中MGMT启动子的甲基化有显著提升，意味着这些改变在早期癌症演变成恶性肿瘤过程中扮演着重要角色［21］．MGMT基因异常的甲基化可以成为组织病理学评估的一个有效辅助工具来预测癌前病变、肿瘤恶变的风险［22］．同时在组织和血液样本中，MGMT基因相似的甲基化表达谱提示，可以利用血液作为潜在的可替代组织样本，对癌前病变和早期癌症进行筛查和诊断［22］．

4 TP73

TP73基因编码p73蛋白，该蛋白属于p53家族，调控细胞周期并诱导细胞凋亡［14］．较 p53而言，TP73在人类癌症中不常发生突变，其沉默通常是因为启动子的高甲基化［14］．Khor等［14］应用 MSP技术对OSCC的石蜡包埋组织中TP73基因的甲基化状态进行检测，发现TP73在OSCC中甲基化水平百分数为92．5%（n＝37），这表明OSCC中TP73呈高甲基化．Jha等［23］报告中对单独的候选基因进行健康和口腔癌群体的MSPCR队列分析验证，并证实了现有生物标志物TP73基因启动子中有超甲基化区域．同样，Noorlag等［24］对该基因的甲基化检测也支持这个结果．因此，TP73可能会在未来几年中成为诊断，预后和靶向治疗OSCC的潜在生物标志物．

5 p53和BRD7

p53基因是公认的肿瘤抑制基因，存在野生型和突变型．野生型p53基因翻译野生型p53蛋白发挥抑癌作用，维持细胞正常生长，抑制恶性增殖［15，25］．突变型p53不但丧失抑癌作用，并表达癌基因的功能．在OSCC组织中p53的表达会随着恶性程度的增高而上升［26］．BRD7是一种新型肿瘤抑制基因，其蛋白质产物含单个结构域．BRD7作为肿瘤抑制基因p53的一种转录辅助因子，该蛋白质产物在细胞周期阻滞中对基因的转录激活起着十分重要的作用［27］．Balasubramanian等［28］研究表明，在23例OSCC样本中有74%的样本BRD7启动子甲基化．这表明甲基化介导的BRD7抑制可能频繁发生在高分化的OSCC中．由于本研究BRD7启动子甲基化的发生率更高，故认为在OSCC中BRD7表达缺失较p53更为频繁［27，29］．基于已有的实验结果，认为BRD7基因的状态比p53更适合作为OSCCs早期诊断的生物标志物［28］．因而BRD7可以作为一种新的潜在OSCC标志物．

6 结语

近年来，随着OSCC的发病率持续升高，以及对口腔癌前病变和OSCC的实验室研究愈加深入，发现DNA启动子甲基化在其中发挥着极其重要的作用．通过实验室研究和临床研究相交叉，进一步研究启动子异常高甲基化在口腔癌发生发展过程中的机制，探索口腔癌前病变发展至口腔癌的相应表观遗传学上的特征性表现，不同临床类型OSCC患者的相关基因启动子甲基化程度和特异性基因改变位点，寻找灵敏度和特异性更高的肿瘤标志物，将有利于口腔癌的临床筛查、诊断、治疗及预后．亦可以探索不同位点启动子异常甲基化之间的联系，结合临床实际情况，进行多基因启动子甲基化的联合实验室检查为患者提供更为精准的医疗服务，进而更新目前的治疗方式或探索新的治疗方向，提高OSCC患者的生存率，改善其预后情况，与此同时，可节约有限的医疗服务资源．

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A．Cancer statistics，2013［J］．CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30．

［2］da Silva SD，Ferlito A，Takes RP，et al．Advances and applications of oral cancer basic research［J］．Oral Oncol，2011，47（9）：783-791．

［3］Scully C．Oral cancer aetiopathogenesis；past，present and future aspects［J］．Med Oral Patol Oral Cir Bucal，2011，16（3）：e306-e311．

［4］Warnakulasuriya S．Global epidemiology of oral and oropharyngeal cancer［J］．Oral Oncol，2009，45（4-5）：309-316．

［5］Ng JH，Iyer NG，Tan MH，et al．Changing epidemiology of oral squamous cell carcinoma of the tongue：A global study［J］．Head Neck，2017，39（2）：297-304．

［6］Patel SC，Carpenter WR，Tyree S，et al．Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women，age 18 to 44 years［J］．J Clin Oncol，2011，29（11）：1488-1494．

［7］Saulnier A，Vaissière T，Yue J，et al．Inactivation of the putative suppressor gene DOK1 by promoter hypermethylation in primary human cancers［J］．Int J Cancer，2012，130（11）：2484-2494．

［8］Khor GH，Froemming GR，Zain RB，et al．Involvement of CELSR3 Hypermethylation in Primary Oral Squamous Cell Carcinoma［J］．Asian Pac J Cancer Prev，2016，17（1）：219-223．

［9］Foy JP，Pickering CR，Papadimitrakopoulou VA，et al．New DNA methylation markers and global DNA hypomethylation are associated with oral cancer development［J］．Cancer Prev Res（Phila），2015，8（11）：1027-1035．

［10］Towle R，Truong D，Hogg K，et al．Global analysis of DNA methylation changes during progression of oral cancer［J］．Oral Oncol，2013，49（11）：1033-1042．

［11］Arantes LM，de Carvalho AC，Melendez ME，et al．Methylation as a biomarker for head and neck cancer［J］．Oral Oncol，2014，50（6）：587-592．

［12］Zhang H，Nan X，Li X，et al．CMTM5 exhibits tumor suppressor activity through promoter methylation in oral squamous cell carcinoma［J］．Biochem Biophys Res Commun，2014，447（2）：304-310．

［13］Li H，Guo X，Shao L，et al．CMTM5-v1，a four-transmembrane protein，presents a secreted form released via a vesicle-mediated secretory pathway［J］．BMB Rep，2010，43（3）：182-187．

［14］Khor GH，Froemming GR，Zain RB，et al．Screening of differential promoter hypermethylated genes in primary oral squamous cell carcinoma［J］．Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（20）：8957-8961．

［15］Pande P，Soni S，Kaur J，et al．Prognostic factors in betel and tobacco related oral cancer［J］．Oral Oncol，2002，38（5）：491-499．

［16］Esteller M．Epigenetics in cancer［J］．N Engl J Med，2008，358（11）：1148-1159．

［17］Sabharwal A，Middleton MR．Exploiting the role of O6-methylguanine-DNA-methyltransferase（MGMT）in cancer therapy［J］．Curr Opin Pharmacol，2006，6（4）：355-363．

［18］Plass C．Cancer epigenomics［J］．Hum Mol Genet，2002，11（20）：2479-2488．

［19］Das PM，Singal R．DNA methylation and cancer［J］．J Clin Oncol，2004，22（22）：4632-4642．

［20］Díez-Pérez R，Campo-Trapero J，Cano-Sánchez J，et al．Methylation in oral cancer and pre-cancerous lesions（Review）［J］．Oncol Rep，2011，25（5）：1203-1209．

［21］Bhatia V，Goel MM，Makker A，et al．Promoter region hypermethylation and mRNA expression of MGMT and p16 genes in tissue and blood samples of human premalignant oral lesions and oral squamous cell carcinoma［J］．Biomed Res Int，2014，2014：248419．

［22］Suga Y，Miyajima K，Oikawa T，et al．Quantitative p16 and ESR1 methylation in the peripheral blood of patients with nonsmallcell lung cancer［J］．Oncol Rep，2008，20（5）：1137-1142．

［23］Jha AK，Nikbakht M，Jain V，et al．Promoter hypermethylation of p73 and p53 genes in cervical cancer patients among north Indian population［J］．Mol Biol Rep，2012，39（9）：9145-9157．

［24］Noorlag R，van Kempen PM，Moelans CB，et al．Promoter hypermethylation using 24-gene array in early head and neck cancer：better outcome in oral than in oropharyngeal cancer［J］．Epigenetics，2014，9（9）：1220-1227．

［25］Yakushiji T，Noma H，Shibahara T，et al．Analysis of a role for p16／CDKN2 expression and methylation patterns in human oral squamous cell Carcinoma［J］．Bull Tokyo Dent Coll，2001，42（3）：159-168．

［26］刘宏伟，胡碧琼，曹采方，等．p16和p53蛋白在口腔白斑和鳞状细胞癌中表达的比较研究［J］．现代口腔医学杂志，2005，19（6）：607-611．

［27］Drost J，Mantovani F，Tocco F，et al．BRD7 is a candidate tumour suppressor gene required for p53 function［J］．Nat Cell Biol，2010，12（4）：380-389．

［28］Balasubramanian A，Subramaniam R，Narayanan V，et al．BRD7 promoter hypermethylation as an indicator of well differentiated oral squamous cell carcinomas［J］．Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（4）：1615-1619．

［29］Mantovani F，Drost J，Voorhoeve PM，et al．Gene regulation and tumor suppression by the bromodomain-containing protein BRD7［J］．Cell Cycle，2010，9（14）：2777-2781．

Advance in researches on genes promoter methylation as a potential diagnostic indicator for oral squamous cell carcinoma

WANG Han-Jie1，SHEN Jia-Cheng1，LIANG Qiao-Mei1，LIU Wei21Basic Medical College，Hebei Medical University，2Department of Immunology，Basic Medical College of Hebei Medical University，Key Laboratory of Immune Mechanism and Intervention on Serious Disease，Shijiazhuang 050017，China

DNA methylation，a form of epigenetics，is used as a natural regulatory mechanism to suppress the expression of non-essential genes，which plays an important role in the maintenance of cell function．The aberrant methylation of the promoter can reduce the expression of genes，promoting the progression of varieties of carcinomas in a certain extent．In recent years，a large quantity of studies have found that genes promoter methylation can serve as potential and sensitive biomarkers for oral squamous cell carcinoma，achieving early diagnosis and tracking the prognosis of cancer．

oral squamous cell carcinoma；epigenetics；promoter methylation；biomarker

R783．1

A

2095-6894（2017）05-44-03

2017-01-20；接受日期：2017-02-07

河北省科技计划项目（152777201）；河北省博士后科研项目择优资助项目（B2015003029）；河北省高等教育学会项目（GJXH2013-135）

王翰杰．研究方向：表观遗传学．E-mail：egberthan＠126．com

刘 伟．博士，副教授．E-mail：liuweihebmu＠hebmu．edu．cn