风味甜瓜中柠檬酸代谢研究进展及RNA—seq技术应用现状

汤谧++刘晔++任俭++张娜++曾红霞++程维舜++李煜华++孙玉宏

摘 要：随着人们生活水平的提高，兼具品质、营养和健康特征的甜瓜新品种——风味甜瓜应运而生，探索适度的风味甜瓜糖酸比非常重要，而目前对甜瓜果实中主要有机酸成分柠檬酸的代谢机制尚不清晰，因此，综述了风味甜瓜果实柠檬酸代谢特性的研究进展，并对利用RNA-seq技术分析甜瓜果实柠檬酸代谢关键基因的挖掘提出了一些展望。

关键词：风味甜瓜；柠檬酸；RNA-seq技术；基因挖掘；研究进展

中图分类号：S651 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2016）24-0040-05

甜瓜（Cucumis melo L.），葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜属（Cucumis）一年生蔓性草本植物。其果实通常呈球形或长椭圆形，果皮平滑，有纵沟纹；果肉白色、黄色或绿色，味美甘甜；含有丰富的蛋白质、维生素、烟酸、钙、铁等营养物质，是夏季常见的消暑瓜果之一，在果蔬生产和消费中占据着重要地位。2012年全国甜瓜播种面积达41万hm2，总产量高达1 330万t，已稳超麻类、烟草等经济作物，成为农业增产、农民增收的高效园艺作物（《全国西瓜甜瓜产业发展规划（2015-2020年）》；2014年，全国甜瓜播种面积达43.89万hm2，总产量达1 475.80万t（《中国农业统计资料（2014）》）。但是随着人们生活水平的提高，传统的高糖纯甜单一口味的甜瓜已不能满足人们的多样化需求，兼具品质、营养和健康特征的果蔬越来越受欢迎，糖、酸含量较高的甜瓜新品种——风味甜瓜因此问世。

外观、营养和风味是决定甜瓜品质的关键，而风味品质是消费者尤为追求的。甜瓜风味品质主要由可溶性糖和有机酸的含量决定，适当的糖酸比有助于果实风味品质的提升，产生最佳的口感[1]。因此，研究这2种物质的调控机制和代谢转化非常重要。研究表明，甜瓜品种不同，其果实内可溶性糖的成分和含量有差异，早熟甜瓜品种，由于生育期短，光合产物提前进入果实，因此其可溶性糖的主要成分是果糖和葡萄糖；中晚熟甜瓜品种，果实发育前期可溶性糖主要成分是果糖和葡萄糖，后期主要是蔗糖[2]，而总糖、果糖、葡萄糖和蔗糖含量均受主基因和多基因控制[3]；甜瓜果实中可溶性糖的积累主要发生在果实发育的中后期，其与蔗糖磷酸合成酶和酸性转化酶的活性有关，若合成酶活性升高而转化酶活性降低，糖分就会不断积累[4]。除此之外，温光因子也会影响糖分含量的积累，如日温差积累对果实总糖含量有影响，有效积温积累对果实葡萄糖含量有影响，而有效辐射积累对果实果糖和蔗糖含量均有影响[3]。

有机酸成分和含量也是影响果实风味品质的主要因素，其成分以柠檬酸为主，还包括苹果酸、琥珀酸等。研究表明，甜瓜中有机酸积累的遗传多态性较低；此外，日温差积累对果实总酸、柠檬酸、苹果酸含量影响较大[3]，而在目前研究中对于调控柠檬酸代谢的调控机制还不是特别清晰，其分子标记方面的研究也较少[5]，挖掘的关键基因也比较少，因此，运用RNA-seq技术研究甜瓜果实中柠檬酸代谢特性，并挖掘其中主要的调控基因，对提高甜瓜果实柠檬酸的含量具有重要作用。

1 柠檬酸代谢途径研究进展

葡萄糖经过三羧酸循环生成丙酮酸，丙酮酸主要有两方面的去处，一是在丙酮酸脱氢酶的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA（乙酰辅酶A），二是在丙酮酸羧化酶的作用下羧化生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA在柠檬酸合酶的作用下缩合生成柠檬酸。Lobit等[6]利用依赖于简化的线粒体三羧酸循环表示的柠檬酸代谢模型预测了果实快速生长期柠檬酸的含量，该模型仅考虑了三羧酸循环的3个中间体（柠檬酸、苹果酸和丙酮酸），并假设2个组分之间的流动仅受酶活性、温度、初始浓度、目标组分浓度的影响，结果发现，三羧酸循环产生的CO2被呼吸作用同化后，在细胞质和线粒体之间的流动除了受温度和酶活性影响外，主要受两区室之间的浓度梯度影响[3]。

1.1 风味甜瓜中的柠檬酸代谢

经过前人的研究可以看出，风味甜瓜果实中的有机酸主要是柠檬酸[7，8]，其含量占果实鲜质量的1.0%，而传统甜瓜仅为0.2%[9]。研究表明，甜瓜中有机酸含量由主基因和多基因控制，而柠檬酸合成酶、乙烯、Ca2+-CaM信号系统这3类基因的上调表达均与柠檬酸积累有关[3]。汤谧[9]以风味3号甜瓜为研究对象，发现PEPC（柠檬酸合酶）、CS（丙酮酸羧化酶）、IDH（异柠檬酸合酶）和MDH（苹果酸脱氢酶）这4种酶活性变化与柠檬酸含量的变化呈显著相关。可见，在植物细胞中，柠檬酸的积累不是单一的某一生化反应的结果，而是一系列生理过程的综合结果。

1.2 其他园艺作物中的柠檬酸代谢

柠檬酸代谢特性在柑橘类研究中已比较成熟。孙琦[10]指出柠檬酸降解有2条途径：一条途径是在顺乌头酸酶（ACO）的催化下被转化为异柠檬酸，另一条途径是在ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-CL）的作用下，被分解为草酰乙酸和乙酰辅酶A。此外，柠檬酸通过谷氨酸代谢途径也从两方面实现了转化和减酸，一是在GAD（谷氨酸脱羧酶）的作用下，柠檬酸进入GABA（γ-氨基丁酸） 循环而被消耗，二是在GS（谷氨酰胺合成酶）的催化下形成谷酰胺，进入氨基酸代谢途径。柠檬酸在柑橘中的代谢机制表现为柠檬酸→异柠檬酸、酮戊二酸和谷氨酸，此后谷氨酸被分解（分解代谢的途径为谷氨酸→GABA→琥珀酸半醛→琥珀酸）或者用于合成谷氨酸盐[9]。在研究柠檬酸与苹果酸的转运途径时，Rafaelr等[11]主要研究了其在柠檬酸通道中的作用，结果发现，苹果酸能强烈地抑制柠檬酸离子通道运输，但对依赖ATP的柠檬酸转运影响很小，因此认为在柑橘果肉细胞中，柠檬酸及苹果酸进入液泡的通道相同。柠檬酸从细胞质转运到液泡时，需要通过液泡上的H+-ATP酶（V-ATPase）调节，同时在转运的过程中也伴随着质子的流动[12]。

2 风味甜瓜中调控柠檬酸代谢的主要基因研究进展

虽然对于风味甜瓜果实中柠檬酸的代谢机制的研究尚不清楚，但目前运用分子标记等现代生物技术已挖掘了其中的一些关键基因。Cohen等[13]将与柠檬酸含量有关的数量性状位点（QTL）定位到连锁群上，结果检测到5个和柠檬酸含量有关的QTLs，其分别位于LGⅣ、LGⅧ、LGⅪ、LGⅫ上。朱慧芹[14]利用六世代联合分离分析法发现，柠檬酸含量受1对加性-显性主基因和加性-显性上位性多基因（D-O）控制。朱慧芹等[15]以口感酸甜味差异明显的甜瓜品种为研究对象，定位了3个与柠檬酸含量有关的QTL（cit7.1、cit8.1、cit8.2），结果发现其分别位于LGⅦ、LGⅧ上；林琼[16]发现在柑橘中，其柠檬酸降解以谷氨酰胺途径为主，而最有可能与CitCHX、CitAL-MT和CitDIC这3个转运蛋白基因有关。

3 RNA-seq技术的发展现状及其在主要作物中的应用

3.1 RNA-seq技术及其发展现状

RNA-seq就是通过高通量测序技术，检测mRNA、smallRNA、LncRNA等的序列信息，研究其表达水平的一种方法。现如今，高通量测序技术已广泛运用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域，并在农业领域获得诸多成果。例如在果蔬作物的研究中，已完成对葡萄、番木瓜、苹果、草莓、香蕉、梨、甜橙、克里曼丁柑橘和桃等作物的全基因组测序，这有助于在相关物种上开展基因和启动子挖掘、分子遗传标记开发、全基因组关联分析、比较基因组学等研究[17]。转录组是连接基因组与代谢组的纽带，转录组测序是对已完成全基因组测序物种进行深入研究的有效方法[18]。相较于基因组学，转录组学针对的是被转录表达的部分特定基因，其研究范围缩小，针对性更强。

与传统的EST测序或芯片技术相比，RNA-seq技术对转录物及其可变剪切体表达水平的检测更加精确，并有助于新的基因、转录产物的发掘及基因结构变化的发现。因此，RNA-seq被认为是转录组研究的一个革命性工具[19，20]。目前应用比较普遍的测序平台是Illumina，如运用HiSeq 2000测序仪，采用边合成边测序的技术手段，能同时检测数亿条序列信息，并对表达丰度极低的序列有较好的检测效果[21]。

3.2 RNA-seq 技术在农业领域中的应用

对于已知全基因组序列的物种，比对转录组测序信息，可以研究基因的表达差异、结构变化，并发现新基因。近年来，该技术得到广泛运用，并取得了良好结果。Filichkin 等[22]对拟南芥（Arabidopsis thaliana）转录组进行测序，发现至少42%的内含子基因存在可变剪接；Zhang等[23]对水稻（Oryza sativa）转录组进行深度测序，发现了7 232个有组织特异性的新转录本和23 800个可变剪接，为分析水稻复杂的转录机制提供了广泛的依据；李滢等[24]应用Roche 454（GS FLX Titanium System）对二年生丹参根的转录组进行测序，研究其基因表达谱，挖崛其功能基因，共获得18 235条Unigene，其中，13 980条Unigene为首次发现。于安民[25]采用高通量RNA-seq测序技术，首次获得了阳春砂的转录组信息和3个不同发育期果实的表达谱信息，为阳春砂果实发育过程中糖和萜类代谢的研究提供了重要的遗传信息，为深入研究阳春砂果实发育及次生代谢调控的分子机制奠定了重要基础。

3.3 RNA-seq 技术在园艺作物中的应用

Zenoni等[26]通过Illumina GA Ⅱ测序平台，对葡萄（Vitis vinifera）坐果、着色、成熟3个发育期的果实进行转录组研究，通过与参考基因组比对，发现了多个MYB转录因子家族、谷胱甘肽转移酶家族的新基因以及可变剪接。杨侃侃[27]通过RNA-seq技术，检测了黄皮、绿皮西瓜在不同生长时期的基因表达变化，发现差异表达的基因主要体现在细胞组成、分子功能、生物过程等方面。冯超[28]对杨梅不同时期的果实进行RNA-seq，分析了杨梅的密码子偏好性并鉴定出4个高频密码子，检测到果实成熟期蔗糖累积和有机酸降解的关键基因，分别是蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因和GAD基因；对不同有机酸含量的杨梅品种进行进一步RNA-seq发现，液泡H+-ATPase（V-ATPase）B亚基的基因可能对不同品种杨梅的有机酸含量起决定作用。魏海蓉[29]通过对不同品种的樱桃进行RNA-seq，共发现18个与花青素生物合成相关的基因。

4 RNA-seq技术在甜瓜中的应用及对果实柠檬酸代谢特性的分析展望

高通量测序技术在甜瓜的研究中也有着广泛的应用。2012年甜瓜基因组测序完成，为关键基因发掘奠定了重要基础。牛鹏辉[30]通过对甜瓜的全基因组数据分析，共鉴定出56个转录因子基因家族，并筛选出14个候选的内参基因。陈嘉贝等[31]对在盐胁迫环境下不同品种甜瓜进行RNA-seq分析，共发现27个响应盐胁迫的转录因子，其中18个转录因子表达量下调，9个上调。

目前，柠檬酸代谢的调控机制还不明确，也只是运用传统的分子标记来进行基因定位。而利用RNA-seq技术进行全基因组测序已成为时代的潮流，运用RNA-seq技术研究甜瓜果实柠檬酸代谢特性，并挖掘其中主要的调控基因，将会为丰富风味甜瓜的品质研究提供可能。

鉴于如今RNA-seq技术的快速发展，以及RNA-seq技术自身的优势，已在很多物种上开展基因和启动子挖掘、分子遗传标记开发、全基因组关联分析、比较基因组学的研究。在甜瓜柠檬酸代谢研究中运用RNA-seq技术，将有助于在甜瓜中挖掘更多调控柠檬酸代谢的基因。下一步我们的研究也将引入转录组学的研究策略，对不同发育时期（前期、中期、后期）的果实进行RNA-seq测序，系统研究果实发育不同阶段的转录组变化，对基因的差异表达进行分析，发现差异表达基因所参与的主要生物学过程，挖掘与柠檬酸代谢有关的基因，构建相关基因的调控网络，分析相关基因在果实不同发育时期的表达水平，同时测定相关基因编码酶在果实不同发育时期的活性以及柠檬酸含量，为揭示风味甜瓜柠檬酸积累的分子机制奠定基础，也为丰富甜瓜果实的品质研究提供可能。

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