郑州地区线粒体基因突变与2型糖尿病相关性分析

荆家琦，张景亮，李晓婷，王骑凤，翟广玉,3*

（1.郑州工业应用技术学院 医学院，河南 郑州 451150；2.郑州市外国语学校，河南 郑州 450001；3.郑州大学 医学院，河南 郑州 450001）

郑州地区线粒体基因突变与2型糖尿病相关性分析

荆家琦1,2，张景亮2，李晓婷2，王骑凤2，翟广玉2,3*

（1.郑州工业应用技术学院 医学院，河南 郑州 451150；2.郑州市外国语学校，河南 郑州 450001；3.郑州大学 医学院，河南 郑州 450001）

探讨线粒体tRNALeu(UUR)基因3243位点和NADH脱氢酶亚单位1（ND1）3394位点突变在河南省郑州地区2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）人群中的发生率及其临床特征。随机抽取无血缘关系的T2DM患者295例及正常对照250名，采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术进行线粒体tRNALeu(UUR)基因3243位点及3394位点突变检测，比较线粒体基因突变在两组间分布的差异，并对样本的相关生化指标进行测定，从而得出河南省郑州地区2型糖尿病与线粒体基因点突变的相关性。2型糖尿病组中mtDNA 3243突变率为0.68%，mtDNA 3394突变率1.36%，在正常对照组未检出mtDNA 3243位点突变，mtDNA 3394突变率0.80%，组间基因型差异用χ2检验，各位点突变率差异均无统计学意义（p＞0.05）。胰岛素水平和线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ活性指标在有无突变组之间有明显差别（p＜0.05）。线粒体tRNALeu(UUR)基因3243和ND1区3394位点突变不是河南省郑州地区2型糖尿病的主要病因，仅为人群中线粒体DNA的基因多态性。但此位点突变能引起空腹胰岛素水平和线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ活性的下降，推测其对2型糖尿病的发生的其他因素有协同作用。

2型糖尿病；线粒体；基因突变

糖尿病（DM）是内分泌系统常见的高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，分为1型糖尿病和2型糖尿病，其中2型糖尿病目前认为其发病原因主要是胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足，病因为遗传因素和环境因素的交互作用[1]，有研究表明线粒体功能障碍在胰岛素抵抗和糖尿病的发病机理中扮演着重要角色，线粒体基因突变与糖尿病的发病有一定的相关性[2]。20世纪90年代首次有报道称线粒体基因突变tRNALeu(UUR)3243引起母系遗传伴耳聋综合症[3]，线粒体DNA（mtDNA）突变是导致家族性糖尿病的重要病因之一。但有的研究也发现一些基因突变与2型糖尿病无关，而仅为正常的多态性[4]。本研究选择河南省郑州地区2型糖尿病病人，对mtDNA 3243及mtDNA 3394位点的突变进行了检测，以揭示这两个位点的突变与河南省郑州地区2型糖尿病患者的相关性。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

糖尿病组为随机选取的河南省郑州地区汉族人，根据1997年世界卫生组织（WHO）糖尿病诊断标准确诊为T2DM的住院患者295例，其中男141例，女154例，年龄（58±10）岁，患者间无亲缘关系；正常对照组为健康体检者250名，其中男130例，女120例，年龄（54±11）岁，无糖尿病及家族史。2组间性别、年龄和体重指数差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

抽取研究对象清晨空腹外周静脉血3～5mL，EDTA抗凝，采用基因组DNA提取试剂盒（北京天根生物科技公司）从白细胞中分离提取DNA。

1.2.2 PCR扩增

扩增相应基因的引物序列分别是，上游引物：5’-TACTTCACAAAGCGCCTTCC-3’，下游引物：5’-ATGA AGAATAGGGCGAAGGG-3’。在50μL反应体系中含10×PCR缓冲液5μL，dNTP 1.5μL（各10mmol/L），引物1和引物2各1.5μL（25 pmol/μL），Taq DNA聚合酶0.5μL（5 U/μL），模板DNA 0.1μg。在PE公司geneAMP PCR system 2400型扩增仪上95℃预变性5 min，95℃变性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳判断目的DNA片段。

1.2.3 PCR产物酶切及检测

取PCR产物配成相应的酶切体系进行酶切反应。针对3243位点扩增产物的酶切体系：PCR产物10μL，10×RE缓冲液2μL，BSA溶液0.2μL，ApaⅠ限制性内切酶1.0μL（10 U/μL），去离子水补至20μL，将上述试剂混勾，置于37℃恒温水浴3～4 h。针对3394位点扩增产物的酶切体系：PCR产物10μL，10×RE缓冲液2.0μL，10%BSA溶液0.2μL，HaeⅢ限制性内切酶1.0μL（10 U/μL），去离子水补至20μL，置于37℃恒温水浴3～4 h。酶切产物经含溴乙锭的3%琼脂糖凝胶电泳后，根据电泳结果判断基因型。

1.2.4 患者临床生化资料采集

记录病例组和对照组人群的民族、年龄、性别、病程、家族史等情况，测量身高、体重计算患者的体重指数（BMI）。检测空腹血糖水平（FBG）、餐后2小时血糖水平（P2BG）、空腹胰岛素水平（FINS）、糖基化血红蛋白（HbA1C）、线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ活性（NADH）等生化指标。

1.2.5 统计学方法

所有实验数据均在SPSS17.0软件中建立数据库，计量资料采用（x±s）表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线粒体DNA片段PCR结果

利用合成的引物分别对病例组和对照组样本的基因组DNA进行PCR扩增后预期目的片段大小为303 bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增产物与预期片段大小相符，且没有非特异性条带的出现，如图1所示。

图1 mtDNA基因片段PCR的结果M：ladder；1、2：PCR产物

2.2 酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果

将PCR扩增产物进行限制性内切酶ApaⅠ和HaeⅢ的酶切后，A3243G突变可产生限制酶ApaⅠ的酶切位点（GGGCC↓C），酶切产物为123 bp、180 bp的2条片段，而未突变基因片段不被酶切，只显示1条条带。而野生型没有ApaⅠ的酶切位点，故电泳只能看到长度为303 bp的1条片段。T3394C突变会使HaeⅢ的酶切位点（GG↓CC）增加，野生型有2个HaeⅢ的酶切位点，电泳理论上应见178 bp、97 bp、28 bp 3条片段；T3394C突变使HaeⅢ酶切位点增加了1个，电泳应见178 bp、78 bp、28 bp、19 bp 4条片段。但由于琼脂糖凝胶的分辨率有限，小于50 bp就不能很好的显示，因此在本实验中我们可以根据出现特异性的78 bp片段判断为T3394C突变，如图2所示。根据酶切结果发现2型糖尿病组中mtDNA 3243突变2例，mtDNA 3394突变4例，在正常对照组未检出mtDNA 3243突变，mtDNA 3394突变2例。同时分析两个基因位点突变在2型糖尿病组及正常对照组之间的差异，经χ2检验，其中mtDNA 3243位点突变在T2DM与正常对照组之间p=0.246，mtDNA 3394位点突变在T2DM与正常对照组之间p=0.375。对比发现二者的发生率在两组之间差别没有统计学意义。

图2 mtDNA基因3243位点和3394位点PCR产物酶切结果图。M：ladder；1：PCR产物；2，3：3394T/C突变型酶切片段；4，5：3243A/G突变型酶切片段

2.3 临床生化资料统计

对所有的研究对象进行了相关临床资料的收集，将检测到突变标本的临床资料进行整理分析，并将突变阳性患者与无突变患者及正常组的主要临床资料进行了比较，如表1所示，其中胰岛素指标在有、无突变组之间差别有统计学意义。数据结果表明线粒体位点突变使空腹胰岛素水平明显下降。

表1 突变阳性患者与无突变患者及正常组临床资料的比较

3 讨论

随着对线粒体疾病认识的不断深入，线粒体基因突变被认为是导致糖尿病的一种新的遗传缺陷。目前已报道与糖尿病发生有关的mtDNA突变达20余种[4]，其中有明确致病作用的是tRNA 3243 A→G点突变，是目前公认的线粒体糖尿病致病点突变，也是国内外文献报道最多的基因糖尿病突变位[5]。mtDNA3243基因突变降低了编码蛋白的稳定性和相应氨基酸与其tRNA的结合力，同时突变还导致与转录终止因子的结合障碍，使相邻rRNA生成减少，从而影响线粒体中氧化磷酸化酶的合成及活性，导致ATP生成不足[6]。目前已有多个地区进行了多种族有关线粒体突变糖尿病的研究。文献报道，全球糖尿病人群中线粒体基因突变发生率约为1.5%，tRNA Leu（UUR）突变引起的占60%左右[7]。我们对河南省郑州地区随机抽取的225例T2DM患者的基因检测发现，郑州地区T2DM患者中mtDNA 3243的突变率为0.68%，研究数据表明此位点可能只是线粒体基因的温和性病理突变，也可能是在其因素的协同作用下引发线粒体糖尿病。

此位点突变在与郑州地区2型糖尿病患者的发生率相关性较低。

1996年，Hirai等[8]发现日本糖尿病患者群存在mtDNA T3394C突变，其突变率为4.9%，正常人群为1.3%。目前研究认为mtDNA3394点突变可使一个中性酪氨酸被亲水性组氨酸取代，改变了ND1空间构型进而影响NADH脱氢酶活性，导致ATP合成减少、胰岛B细胞能量供应不足、影响胰岛素分泌，从而参与T2DM的发生[9]。而本研究在糖尿病人群中发现了mtDNA 3394位点1.78%的突变率，且在正常对照中也发现了1.10%的突变率，从突变阳性组与突变阴性组的临床资料比较中可以看出，mtDNA 3394突变没有影响到患者的平均发病年龄、体重指数及血糖水平。因此我们推断mtDNA 3394突变可能仅为mtDNA的基因多态性，目前还不能证实该突变与糖尿病的发病有直接关系，还有待于通过以后的研究来证实mtDNA3394突变是否具有致病性。

线粒体基因突变DM患者的临床表型多样化，与其致病原因之间并非简单的对应关系[10]。本研究因样本含量有限，对线粒体基因突变与2型糖尿病的相关性研究还不够完善。在今后的研究中可以通过增加病例数，提高标本来源的特异性来提高线粒体突变DM的阳性诊断率；同时对于可能导致线粒体功能异常的核基因缺陷进行研究，从而帮助我们逐步了解线粒体基因突变DM的发病机理，并为将来的针对性治疗提供可能。

[1]高 静，段 畅，李丽娟.2型糖尿病发病机制的研究进展[J].医学综述，2015，11（21）：3935-3938．

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Correlation analysis on mitochondrial DNA gene mutation in type 2 diabetes mellitus in Zhengzhou

JING Jia-qi1,ZHANG Jing-liang2,LI Xiao-ting2,WANG Qi-feng2,ZHAI Guan-yu2,3*
(1.Zhengzhou Foreign Language School,Zhengzhou Henan451100,China;2.College of Medicine,Zhengzhou University of Industrial Technology,Zhengzhou Henan451100,China;3.College of Medicine,Zhengzhou University,Zhengzhou Henan450001,China)

To investigate the prevalence and the clinical characteristics of mitochondrial DNA(mtDNA)dot mutation at position tRNALeu(UUR)3243 and NADH dehydronase subunt 3394 in patients with type 2 diabetes mellitus in Zhengzhou area.Methods 295 cases of T2DM patients in Zhengzhou area were selected randomly and 250 individuals were healthy controls.The presence of mtDNA 3243 and mtDNA 3394 mutations was determined by PLC-RFLP technique.To compare the differences in the distribution of mitochondrial mutation between the two groups,and to determine the biochemical parameters of the samples,so as to obtain the correlation between type 2 diabetes mellitus and mitochondrial gene point mutations in Zhengzhou area,Henan province.The frequency of mtDNA 3243A mutation was 0.68%in T2DM group and 0 in healthy control group,and the frequency of mtDNA 3394 mutation was 1.36%in T2DM group and 0.80%in healthy control group.No statistical differences in the fre-quency of the two mutations were found between these two groups.Insulin levels and mitochondrial respiratory chain enzyme complex I activity indexes were significantly different between the groups with and without mutation.Mutations of mitochondrial gene tRNALeu(UUR)3243 and ND1 region 3394 are not the main causes of type 2 diabetes mellitus in Zhengzhou area of Henan Province,and only the genetic polymorphism of mitochondrial DNA in the population.But the mutations can cause the decrease of fasting insulin level and mitochondrial respiratory chain enzyme complex I activity,it is speculated that they have a synergistic effect on the other factors of type 2 diabetes.

type 2 diabetes mellitus;mitochondrial;gene mutation

R394.3

代码：A

：1004-4329（2016）04-058-04

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2016)04-058-04

2016-06-13

河南省科技厅项目（142102310151）；河南省教育厅项目（14A310028）；郑州市地方高校生化药学名师工作室（郑教高[2015]70号）资助。

翟广玉（1954- ），男，学士，教授，研究方向：生化药学。Email：Zhaiguangyu1@sina.com。