生物酶提取申嗪霉素工艺的研究

姚陈伟

(上海农乐生物制品股份有限公司，上海201419)

生物酶提取申嗪霉素工艺的研究

姚陈伟

(上海农乐生物制品股份有限公司，上海201419)

申嗪霉素是一种广谱抗真菌类微生物源抗生素，在田间使用中低毒、无残留。研究了生物酶法提取申嗪霉素精品，利用生物酶安全环保无毒性的特点，在不同温度和添加量的情况下，研究溶解酶和凝聚酶的最适温度和最佳添加量。结果表明，溶解酶30 ℃、添加量7%和凝聚酶25 ℃、添加量6%时，采用这一提纯工艺方法可以显著提高申嗪霉素的纯度，纯度达到90%以上。

申嗪霉素；溶解酶；凝聚酶；安全；环保；纯度

申嗪霉素(phenazine-1-carboxlic Acid，PCA)是荧光假单胞菌分泌的一种微生物源杀菌剂，具有广谱抗菌作用，能够预防和治疗多种农作物根际土传病害和多种真菌病害(如西瓜枯萎病、辣椒疫病、小麦根腐病、水稻纹枯病、水稻稻曲病、水稻稻瘟病等)。同时，申嗪霉素具有毒性低、对生态环境友好，在农作物中残留少，用量少，效果好等特点。

图1 申嗪霉素结构式

申嗪霉素市场前景广阔。它的制剂为水悬浮剂，为水基化环保新剂型。这种剂型对申嗪霉素原药的纯度要求很高，如果申嗪霉素原药的纯度达不到要求，就会严重影响水悬浮剂产品的质量稳定性。经过创新生物技术的菌株改造、优化、筛选，申嗪霉素产品技术水平不断提升，目前大生产中申嗪霉素的发酵单位可达5 000 mg/L以上。但是申嗪霉素发酵液成分复杂，培养基残渣、菌丝体和大量的杂质都使得发酵液的提取变得困难重重，要想得到纯度高的申嗪霉素更是难上加难。因此取得高纯度的申嗪霉素原药，必须进行高难度的技术攻关。

申嗪霉素是一种完全自主创新的生物农药，目前对申嗪霉素的分离和纯化的研究非常有限，研究人员还是采用化学法提纯工艺。化学法提纯工艺中使用的化学有机溶剂具有脂溶性，除经呼吸道和消化道进入人体外，还可经皮肤被人体迅速吸收。化学有机溶剂进入人体后将作用于富含脂类物质的神经、血液系统，以及肝肾等实质脏器，对人体造成直接伤害。化学有机溶剂对皮肤和黏膜也有明显的刺激性，并对人体有致癌、致突变、致畸变的严重危害。据世界卫生组织估计，发展中国家每年约有50万人遭受化学物质危害，有近5 000人死亡。除此以外，化学有机溶剂的使用对环境的破坏作用严重。更加之，化学有机溶剂的生产也是重要的安全隐患源，是造成安全事故的重要原由。在申嗪霉素产品的生产过程中，采用安全环保的提纯工艺刻不容缓。

经过技术创新，申嗪霉素的提取技术有较大的提高。从绿色、生物的角度出发，以生物酶为主要的介质，进行申嗪霉素发酵液的分离，并不断优化目的物质的提纯工艺，使产品的纯度达到预定的指标。

生物酶是一种无毒、对环境友好的生物催化剂，其化学本质为蛋白质。生物酶的生产和应用，在国内外已具有80多年历史。20世纪80年代后，酶的制造和应用领域不断扩大。生物工程作为一门新兴高新技术在我国得到了迅速发展，酶在发酵工业中的应用日渐成熟。现在生物酶处理工艺已被公认为是一种符合环保要求的绿色生产工艺，它使发酵工业工艺得到改善和提高。同时生物酶具有无毒无害，可生物降解，对环境无污染，有利于生态的维护，生产过程安全等很多优点而成为发酵液提取工艺创新研究的热点。

笔者采用生物酶降解分离纯化法，能够有效解决分离纯化和环境保护、安全生产等诸多难题，并且以较低的成本获得较高纯度的申嗪霉素。

1 材料和方法

1.1 试验材料

⑴ 申嗪霉素粗品(上海农乐生物制品股份有限公司自行生产)

申嗪菌株摇瓶培养后经20 t发酵罐罐体发酵，发酵液简单固液分离烘干后，粉碎得到申嗪霉素粗品。

⑵ 生物溶解酶RJM02、凝聚酶NJM05(上海农乐生物制品股份有限公司)、化学试剂乙腈、冰乙酸。

1.2 试验设备与分析仪器

高效液相色谱仪(岛津)、C18柱、台式离心机(TGL-16B，上海安亭科学仪器厂)、超声波清洗器(2101T，上海安谱科学仪器有限公司)、隔膜真空泵(GM-0.15，天津市腾达过滤器件厂)。

1.2 试验方法

1.2.1 粉碎、溶解

将含量在40%～50%左右的申嗪霉素粗品进行粉碎，加水搅拌稀释，添加水量按照100倍的液固重量比例，加水后搅拌2～3 h使其充分溶解。

考察在不同温度以及不同添加量的条件下添加溶解酶RJM02，研究申嗪霉素的溶解性，找出最适温度和最佳添加量。添加时搅拌器的搅拌速度为200 rpm，搅拌时间为0.5 h，使稀释液充分溶解，该程序完成后进行板框过滤，过滤压力0.1 MPa，收集过滤液备用。

1.2.2 过滤液结晶

对不同温度下生物凝聚酶NJM05(上海农乐生物制品股份有限公司生产)的活性进行研究，生物凝聚酶NJM05加入量为5%～7%(重量比计)，在最适温度和最佳添加量条件下添加凝聚酶。加入时以100 rpm转速搅拌使之均匀，搅拌时间为2 h，搅拌完成后静置6 h使之充分结晶，然后板框过滤，过滤时板框压力为0.05 MPa。

1.2.3 烘干、粉碎成品

结晶液过滤板框后，申嗪霉素结晶品形成滤饼留在板框滤布上，收集结晶品，然后将结晶品送入烘房烘干，粉碎，就得到需要的成品。

1.2.4 测定

HPLC法测定申嗪霉素的效价(含量)。色谱条件：C18柱，流动相(体积比，乙腈︰水︰冰醋酸= 40︰60︰0.2)，检测波长：248 nm，流速1 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL。

取溶解液40 μL于1.5 mL离心管中，加入960 μL乙腈超声溶解5 min，离心机10 000 rpm离心5 min，取离心管上清液进样，检测，PCA含量为90%左右。

2 结果与讨论

2.1 生物溶解酶作用温度选择

生物酶主要作用机理是诱导契合，当底物结合到酶的活性部位时，酶的构象有一个改变。底物诱导酶蛋白构象的变化，导致催化基团的正确定位与底物结合到酶的活性部位上去。

图2 PCA液相检测图谱

表1 不同温度下RJM02对申嗪霉素的水解作用

在30 ℃左右时，底物能够最大限度与酶结合，说明在此温度下酶的活性最高，能够有效结合目标产物。

2.2 凝聚酶作用的最适温度

凝聚酶于水中与目标产物发生酶促反应，凝聚成晶体使之发生沉淀。申嗪霉素形成有效结晶体之后通过板框过滤，形成的滤饼即为纯度较高的申嗪霉素。

絮凝酶NJM05在温度25 ℃，添加量6%时，申嗪霉素能够最大限度形成有效晶体，回收率最高。

3 结 论

试验研究表明，温度为30 ℃时申嗪霉素在溶解酶RJM02作用下保持溶解，然后用生物絮凝酶NJM05在25 ℃左右结晶，能以最大收率回收目标产物，目标产物纯度为90%左右。生物酶工艺达到了提取纯化申嗪霉素和保护环境，安全生产的多重效果。

表2 NJM05在不同温度下的结晶效果

试验表明，生物酶技术在改进生产工艺，节约能耗，安全生产，减少环境污染，提高产品质量，增加附加值和开发新型原料的产品等方面都具有独特的优势。随着技术的进步，生物酶技术将在各种领域的工程技术中得到更广泛的应用。

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Study on the Application of the Biological Enzyme in the Extracting Process of Phenazine-1-carboxylic Acid

YAO Chen-wei
(Shanghai Nongle Biological Products Co., Ltd., Shanghai 201418, China)

Phenazine-1-carboxylic acid is a broad-spectrum antifungal microbe derived antibiotics in the field are in use, low toxicity and no residue. This paper studies the enzymatic extraction of phenazine-1-carboxylic acid products, using non-toxic environmentally safe biological enzyme, in different temperature and adding quantity, the optimum temperature and optimum amount study on the dissolving enzyme and condensed enzyme. The experiment showed that lytic enzyme addition of 7% at 30 ℃ and at 25 ℃ 6% addition of enzyme condensation, the purification process can significantly improve the purity of phenazine-1-carboxylic acid, reached more than 90%.

phenazine-1-carboxylic acid; dissolve enzyme; condensation enzyme; security; environmental protection; purity

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2016.06.04

TQ450

：A

1009-6485(2016)06-0025-03

姚陈伟(1982—)，男，汉族，工程师，主要从事细菌、放线菌的培养和工业化生产工作。Tel： 021-37571353，E-mail： gxjcxp@126.com。

2016-10-25。