美金刚减轻异氟烷麻醉引起的老年小鼠认知功能障碍*

王 强， 孟京华， 吕 丹， 舒 榕△

1武汉科技大学医学院病原生物与免疫学系，武汉 4300862湖北省第三人民医院麻醉科，武汉 430033



美金刚减轻异氟烷麻醉引起的老年小鼠认知功能障碍*

王 强1， 孟京华2， 吕 丹1， 舒 榕2△

1武汉科技大学医学院病原生物与免疫学系，武汉 4300862湖北省第三人民医院麻醉科，武汉 430033

目的 研究异氟烷麻醉对老年小鼠神经行为和学习记忆能力的影响，并探讨其可能的机制及美金刚的保护作用。方法 60只45周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分成3组：对照组(Con)、异氟烷组(Iso)、美金刚+异氟烷组(Mem+Iso)。Con组的小鼠仅吸入氧气2 h，Iso组的小鼠吸入混合1.5%异氟烷的氧气2 h，Mem+Iso组小鼠在吸入异氟烷前2 h，以8 mg/kg美金刚灌胃，Con组和Iso组小鼠用等量生理盐水灌胃。在异氟烷处理后12 h时每组取10只小鼠分离海马组织进行Western blot检测磷酸化-tau(P-tau)蛋白表达，ELISA法检测IL-1β水平。异氟烷处理后48 h剩余小鼠进行Morris水迷宫实验。结果 与Con组比较，Iso组小鼠空间学习记忆能力明显下降，海马P-tau表达上调，IL-1β水平明显增加(均P<0.05)；与Con组比较，Mem+Iso组小鼠空间学习记忆能力、海马P-tau表达、IL-1β水平差异无统计学意义(均P>0.05)；与Iso组相比，Mem+Iso组小鼠空间学习能力明显增强，海马内P-tau表达下调，IL-1β水平明显减少(均P<0.05)。结论 异氟烷麻醉能使老龄小鼠发生认知功能障碍，引起海马P-tau、IL-1β水平增加；而美金刚可改善其行为认知损害，下调P-tau、IL-1β表达，对异氟烷麻醉引起老年小鼠认知功能障碍具有保护作用。

美金刚； 异氟烷； 老年小鼠； 认知功能障碍

随着我国人口老龄化，老年手术患者日益增多。研究显示，年龄超过60岁的患者在手术后3个月，12%的人发生认知功能障碍，主要临床表现为口头及空间记忆困难、思考时间延长、注意力难以集中等方面，这是多种因素包括年龄、受教育程度、动脉粥样硬化、麻醉、手术、围术期并发症等相互影响的结果[1-3]。神经受体的过度激活可导致神经元内钙超载，造成神经元损伤和死亡，与阿尔茨海默病的发病有关。美金刚(Memantine)是一种低中亲和力、非竞争性、强电压依赖性的N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂，可以阻断过度开放的受体，有效调控兴奋性递质，减缓神经退化过程。本实验研究了异氟烷麻醉对老年小鼠认知功能的影响，并探讨其可能的机制及美金刚的保护作用，为进一步评估老年患者术后认知功能障碍的风险因子及干预提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

主要实验仪器包括麻醉气体检测仪(Datex-Ohmeda公司)、血气分析仪(Bayer公司)。主要实验试剂包括异氟烷(Baxter公司)、美金刚(Lundbeck公司)、小鼠P-tau单克隆抗体(Santa Cruz公司)、兔β-actin多克隆抗体(Sigma公司)、HRP标记的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗(武汉博士德公司)。

1.2 实验动物和分组

60只45周龄、体重27～32 g的雄性C57BL/6小鼠，购自湖北省实验动物研究中心，随机分成3组(n=20)：对照组(Con)、异氟烷组(Iso)、美金刚+异氟烷组(Mem+Iso)。饲养房间温度控制在(23±0.5)℃，并保持12 h的明/暗光照周期。所有小鼠在运达实验动物中心后至少保持1周的适应期。Iso组的小鼠吸入混合1.5%异氟烷的氧气2 h；Con组的小鼠仅吸入氧气2 h；Mem+Iso组小鼠吸入异氟烷前2 h，给予8 mg/kg美金刚灌胃(根据预试验结果确定美金刚用量)，Con组和Iso组小鼠仅以等量生理盐水灌胃。

1.3 异氟烷麻醉

麻醉暴露箱内通入异氟烷和氧气，维持异氟烷浓度1.5%，麻醉2 h。麻醉过程中保持小鼠自主呼吸，并观察呼吸频率，使用麻醉气体检测仪监测麻醉暴露箱内的异氟烷浓度。麻醉结束后将小鼠放回原笼。

1.4 脑组织的收集

异氟烷处理后12 h，将每组10只小鼠在深度麻醉下用生理盐水行心脏灌注、断头，在冰上迅速分离海马组织，用于检测P-tau和IL-1β。

1.5 Western blot法检测海马P-tau表达

用蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂提取组织总蛋白。通过BSA定量后按照40 μg蛋白量上样，各样本等量蛋白行10% SDS-PAGE电泳、转膜，抗小鼠P-tau单克隆抗体(1∶1 000)、兔抗β-actin 4℃孵育过夜，HRP标记的二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，曝光检测P-tau表达，以P-tau/β-actin相对灰度比值代表P-tau的相对表达量。

1.6 ELISA法检测IL-1β

按照ELISA试剂盒说明书加样品和标准品，37℃反应30 min，洗板5次后加入酶标试剂37℃反应30 min，洗板5次后加入显色液A、B，37℃显色10 min，加入终止液，15 min内读取吸光度(A)值，根据标准品的浓度及对应的A值，计算标准曲线的直线回归方程，根据样本的A值，在回归方程上计算出对应样品中IL-1β含量。

1.7 行为学实验

异氟烷处理结束后48 h，每组10只小鼠行Morris水迷宫实验。先置小鼠于平台上适应20 s，随后将小鼠从不同象限(靶象限除外)置入水池内，登上平台5 s后终止记录。如此检测3次，测量平均登台潜伏期和平均靶象限活动时间。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠生理指标的检测

小鼠在麻醉处理过程中唇色红润，呼吸均匀，未出现呼吸抑制；各组血浆的pH值均在正常范围内，差异无统计学意义(P>0.05)；各组均无缺氧表现，PO2与PCO2差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

组别pHPO2(mmHg)PCO2(mmHg)Con7.41±0.03241.8±19.537.9±3.3Iso7.48±0.02223.9±20.239.6±3.0Mem+Iso7.44±0.06221.6±18.640.2±2.3

2.2 Morris水迷宫实验结果

如表2，Iso组与Con组比较，登台潜伏期明显延长，靶象限活动时间明显缩短(均P<0.05)，Mem+Iso组与Iso组比较，登台潜伏期较Iso组明显缩短，靶象限活动时间明显延长(均P<0.05)，Con组与Mem+Iso组间差异无统计学意义(均P>0.05)。

组别登台潜伏期(s)靶象限活动时间(s)Con43.32±8.5958.28±10.76Iso69.35±9.07*40.65±8.32*Mem+Iso45.15±6.78#56.98±12.36#

与Con组比较，*P<0.05；与Iso组比较，#P<0.05

2.3 小鼠海马组织中P-tau蛋白表达水平

Con组小鼠海马组织P-tau表达水平为(0.32±0.02)，Iso组小鼠海马组织P-tau表达水平为(0.58±0.05)，Mem+Iso组小鼠海马组织P-tau表达水平为(0.35±0.04)。Iso组P-tau表达水平明显高于Con组和Mem+Iso组(均P<0.05)，而Mem+Iso组与Con组差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 Con组、Iso组、Mem+Iso组海马组织中P-tau蛋白的表达Fig.1 Expression of P-tau in Con group，Iso group and Mem+Iso group

2.4 小鼠海马组织中IL-1β的表达水平

Iso组海马IL-1β的水平较Con组增加(P<0.05)，Mem+Iso组IL-1β的含量较Iso组减少(P<0.05)，而Mem+Iso组与Con组比较，IL-1β的含量差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

与Con组比较，*P<0.05；与Iso组比较，#P<0.05图2 Con组、Iso组、Mem+Iso组海马组织中IL-1β的表达水平Fig.2 Expression of IL-1β in Con group，Iso group and Mem+Iso group

3 讨论

老年患者手术后出现认知功能障碍是一种临床现象，发病的神经生物学机制尚未阐明，临床上无法对其进行有效干预。研究显示，术后认知功能障碍与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)可能有共同的发病机制，术后认知功能障碍是AD的前期[2，4-5]。P-tau蛋白是AD患者脑内主要病理标志性蛋白之一，它形成神经元纤维缠结并在神经元内聚集，影响微管形成，造成神经元轴突运输障碍，最终引起神经毒性改变[6]。由于术后认知功能障碍与AD具有较大类似性，因此麻醉后老年小鼠的P-tau蛋白改变与AD可能有同样的意义。有研究证明麻醉能增加中枢性炎症的敏感性，导致炎性细胞因子释放，增强炎性反应，而神经炎症反应可损伤认知功能，IL-1β是主要的炎性因子，参与中枢神经系统的免疫调节、影响海马依赖性记忆保持等，是目前手术急性应激中研究较多的细胞因子[7-8]，但它在老年患者术后认知功能障碍中具体扮演什么角色并不清楚。

在一些临床实验中，使用具有神经保护作用的美金刚能部分改善某些临床治疗(如放疗)的认知功能下降副作用[9]。本研究中，我们采用Morris水迷宫测定老年小鼠登台潜伏期及靶象限活动时间，以判断异氟烷麻醉是否引起老年小鼠认知功能障碍，美金刚对老年小鼠是否具有保护作用。结果显示，异氟烷可显著延长小鼠登台潜伏期及缩短靶象限活动时间，这表明异氟烷可诱导老年小鼠产生的认知功能障碍；与Iso组相比，Mem+Iso组小鼠登台潜伏期缩短，靶象限活动时间延长，表明美金刚可减轻异氟烷诱导的老年小鼠产生认知功能障碍。作为学习记忆的核心脑区之一，海马体功能的改变对我们研究临床治疗引发认知功能障碍的机制有着举足轻重的影响。我们采用Western blot法检测了海马组织P-tau蛋白水平、ELISA法检测了海马组织IL-1β的表达。与Con组比较，Iso组小鼠海马P-tau表达上调，IL-1β明显增加；与Iso组相比，Mem+ Iso组小鼠海马内P-tau表达下调，IL-1β明显减少，这表明异氟烷麻醉能使老龄小鼠发生海马P-tau、IL-1β水平增加，可部分解释异氟烷麻醉引起的老年小鼠认知功能障碍；而美金刚可下调P-tau、IL-1β表达，对异氟烷麻醉引起的认知功能障碍老年小鼠具有保护作用。

综上，异氟烷麻醉前施用美金刚进行干预能改善老年小鼠认知功能障碍，下调其海马组织P-tau、IL-1β表达，这为进一步评估预测老年患者术后认知功能障碍的风险因子及干预提供了科学依据。

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(2016-03-22 收稿)

Effect of Memantine on Isoflurane-induced Cognitive Dysfunction in Aged Mice

Wang Qiang1，Meng Jinghua2，Lv Dan1etal

1DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology，MedicalCollegeofWuhanUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430086，China2DepartmentofAnesthesiology,HubeiNo.3ProvincialPeople’sHospital，Wuhan430033，China

Objective To evaluate the effect of Memantine on isoflurane-induced cognitive dysfunction in aged mice.Methods Sixty male C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups：control group (Con)，Isoflurane group (Iso)and memantine+isoflurane group (Mem+Iso)(n=20 in each).The mice in all isoflurane-treated groups were exposed to oxygen mixed with 1.5% isoflurane for 2 h.The mice in Con group were exposed to oxygen only for 2 h.The Mem+ Iso group mice were given memantine (8 mg/kg)by intragastric administration 2 h before exposure to 1.5% isoflurane.The mice in the Con and Iso group were given saline water by intragastric administration.Mice treated with isoflurane were tested in the Morris water maze，in which the latency to the platform and the proportion of time spent in the target quadrant were recorded 48 h after exposure to 1.5% isoflurane.Fresh cerebral hippocampi were dissected to measure the protein expression of P-tau by Western blotting，and the content of IL-1β was analyzed by ELISA 12 h after isoflurane exposure.Results Compared with Con group，the latency to the platform was significantly prolonged，and the proportion of time spent in the target quadrant was decreased significantly and the levels of P-tau and IL-1β increased in the Iso group (allP<0.05).Compared with Iso group，the latency to the platform was significantly decreased，the proportion of time spent in the target quadrant was significantly prolonged，the expression of P-tau and IL-1β significantly decreased in the Mem+Iso group (allP<0.05).Conclusion Isoflurane can induce cognitive dysfunction in aged mice and elevate the level of P-tau and IL-1β in the hippocampus.Memantine can improve cognitive dysfunction and decrease the level of P-tau and IL-1β in aged mice.

memantine； isoflurane； aged mice; cognitive dysfunction

*湖北省中山医院人才学科建设“提升人才”项目(2014)

R614

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.017

王 强，男，1976年生，医学博士，副教授，E-mail：wangqiang@wust.edu.cn

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：251204399@qq.com