宠物犬布氏杆菌的PCR检测及部分序列分析

孙 明，刘巧荣，宋文静，乔明明，顾 强，张 谦，刘伯华，杨雪松，陈西钊*

(1.北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，北京 100094；2.北京关忠动物医院，北京 100025)

宠物犬布氏杆菌的PCR检测及部分序列分析

孙 明1，刘巧荣1，宋文静2，乔明明1，顾 强2，张 谦1，刘伯华1，杨雪松2，陈西钊1*

(1.北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，北京 100094；2.北京关忠动物医院，北京 100025)

对北京关忠动物医院送检的2例疑似感染布氏杆菌宠物犬的7份分泌物进行了布氏杆菌普通PCR、快速实时荧光PCR检测和Multi-PCR鉴定，并对部分基因序列测序分析，旨在对宠物犬感染犬布氏杆菌作出确诊，为宠物犬感染布氏杆菌诊断与防控提供资料。结果显示，布氏杆菌快速实时荧光检测试剂盒对两例犬的7份分泌物检测结果均为布氏杆菌阳性；Multi-PCR检测结果显示，感染犬布氏杆菌属于犬种布氏杆菌，且为非典型犬布氏杆菌；序列分析进一步验证了患犬感染样品扩增的序列均为布氏杆菌序列：BSCP31表面蛋白序列与已经发布的序列相比相似性在99%～100%；OMP25序列与中国内蒙古分离的犬布氏杆菌xue1分离株和韩国BrucellacanisHSK A52141 分离株亲缘关系最为亲近，核苷酸相似性均为99.9%；16S rRNA 序列显示，进口斗牛犬和泰迪犬感染菌株均属于布氏杆菌序列。以上试验结果表明两例宠物犬均为犬布氏杆菌感染，这些数据将为布氏杆菌病的筛查和防控提供一定的基础。

布氏杆菌；宠物犬；PCR检测；序列分析

布氏杆菌病(brucellosis，简称布病)是由布氏杆菌引起的一种以流产和发热为特征的人兽共患病。该病分布广泛，有170多个国家存在此病。该病不仅影响畜牧业的发展，还直接威胁人类健康和公共卫生安全。

1966年L. E. Carmichael等首次在患病犬的组织和阴道分泌物中发现了犬种布氏杆菌[1]。犬种布氏杆菌属于粗糙型菌株，主要引起犬类动物发病，被犬种布氏杆菌感染的犬可引起繁殖障碍(如流产、死胎、不孕等)，也可表现非繁殖障碍症状(如视力缺陷、肌肉关节或皮肤受损等)。近几年，犬的饲养量大幅度增加，越来越多的人选择犬作为宠物，犬的品种繁杂、来源广泛，其疫病也较为复杂，导致犬布病的发病率逐年上升，而犬布病多呈隐性经过，不易察觉，当患病犬流产时才怀疑是布病，因此犬布病的准确检测对犬布病的防控和人类健康和公共卫生安全均有重要的意义。目前，布氏杆菌的检测方法主要有病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断，前两种方法操作耗时、特异性和敏感性有待提高，且存在一定的风险；而以PCR为代表的分子生物学技术不仅用于布氏杆菌种及型的鉴定，还能反映基因间存在的差异，因此可在基因水平上进行分型和疫苗株的鉴定[2]，且PCR方法无风险，耗时短，对布氏杆菌病的监测和确诊具有很大的意义。

笔者对关忠动物医院送检的两例宠物犬的7份分泌物进行了PCR检测和种属鉴定，并对部分基因克隆测序，旨在对宠物犬感染布氏杆菌进行确诊，为犬布病的监测和防控提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 临床背景

病例1：两只进口斗牛犬，一公一母，来自同一窝，4个月，白色。回国后发现有轻微感冒，体温正常，偶尔咳嗽，鼻涕少，眼屎未见增多。其中公犬睾丸发育迟缓。采样：母犬眼鼻分泌物(样品1)和阴道分泌物(样品2)，公犬眼鼻分泌物(样品3)和阴茎分泌物(样品4)。

病例2：母种犬，品种泰迪，2岁，棕色。繁殖史：1岁时怀孕生产，一切正常。第二次怀孕，怀孕不足40 d，流产。采样：眼鼻分泌物(样品5)，阴道分泌物(样品6)，尿液(样品7)。

1.2 菌体染色

将疑似分泌物进行革兰染色，显微镜下观察其形态特征。

1.3 载体和主要试剂

PMD19-T克隆载体、EX-TaqDNA聚合酶购自于大连TaKaRa公司；DH5α感受态细胞购自于北京全式金生物技术有限公司；总DNA提取试剂盒为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司产品，胶回收试剂盒为Omega产品。布氏杆菌(BRU)快速实时荧光PCR检测试剂盒和布氏杆菌PCR检测试剂盒为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司产品。

1.4 引物的设计与合成

根据GenBank上发表的布氏杆菌基因组和相应文献合成以下引物：由上海英骏生物技术有限公司合成，见表1。

表1 PCR扩增引物序列

Table 1 The sequence of the primers for PCR amplification

基因Gene上游引物(5′→3′)Forwardprimer下游引物(5′→3′)Reverseprimer产物大小/bpExpectedsize16SrRNACATGGCTCAGAACGAACGCTACGACTTCACCCCAGTCGCT1420OMP25CATGGGCGGTTTACTCCGGCCAGATCATAGTTC650BSCPGGAACCGATCATTGAGGGATTACTATGCGGGAAGAGGACTGGTA1030

1.5 布氏杆菌DNA提取

按照北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的DNA提取试剂盒操作说明提取布氏杆菌基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.6 布氏杆菌检测

按照北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的布氏杆菌(BRU)实时荧光PCR检测试剂盒和布氏杆菌PCR检测试剂盒说明书进行鉴定。

1.7 Multi-PCR鉴定

1.7.1 菌种鉴定 引物参照文献[3]设计，见表2。根据引物扩增目的片段大小不同判断种属。牛种布氏杆菌能扩增出494和591 bp片段，羊种布氏杆菌能扩增出732和591 bp片段，猪种布氏杆菌能扩增出591和272 bp片段，犬种布氏杆菌能扩增出272 bp片段。

表2 牛羊猪犬种布氏杆菌Multi-PCR引物

Table 2 Multi-PCR primers ofB.abortus,B.melitensis,B.suisandB.canis

引物名称Primers引物序列(5′⁃3′)Primersequence产物大小/bpExpectedsize目的菌种BrucellaspeciesPIS711fTGCCGATCACTTAAGGGCCTTCATP494rGACGAACGGAATTTTTCCAATCCC494B．abortusPIS711fTGCCGATCACTTAAGGGCCTTCATP732rAAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA732B．melitensisP591fCTGGTGGGTATCGCATTACTCGGP591rTTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG591B．abortus、B．melitensis、B．suisP272fGGAACACTACGCCACCTTGTP272rGATGGAGCAAACGCTGAAG272B．suis、B．canis

1.7.2 典型和非典型鉴定 引物参照文献[4]设计，能扩增出836、436和217 bp片段的为典型布氏杆菌，扩增出436和217 bp片段的为非典型犬布氏杆菌，扩增出436、217和大于836 bp的片段不是犬布氏杆菌。

表3 鉴定犬典型和非典型布氏杆菌Multi-PCR 引物

Table 3 Multi-PCR primers of Typical and AtypicalB.canis

引物名称Primers引物序列(5′⁃3′)Primersequence产物大小/bpExpectedsizeB．ab⁃fGTCTTCCTGATTGCGGCTGGB．ab⁃rACCACCAGCGACAGGAACATC436B．can⁃fGGCTTCCTCACGACATACCAGB．can⁃rCTGAACAGGATGCAATGACGC836或大于836B．sul⁃fCCACGAACGAGCGAACAGCB．sul⁃rCGGTAAAGCGTTGATTTCCATG217

1.8 基因扩增

用合成的16S rRNA引物、OMP25引物和BSCP引物对样品1和5进行各基因扩增。扩增使用20 μL体系，依次加入10×ExBuffer 2 μL、10 mmol·L-1dNTP 2 μL、ExTaq0.2 μL、上下游引物各1 μL(10 pmol·μL-1)、灭菌纯水11.8 μL、布氏杆菌DNA 2 μL。扩增程序： 95 ℃ 预变性5 min，95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环后，72 ℃延伸10 min。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后用OMEGA公司胶回收试剂盒回收纯化扩增的目的基因片段。

1.9 扩增产物的亚克隆及测序

分别将PCR扩增得到的相应片段连接到pMD19-T中，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。用PCR方法筛选阳性克隆，将初步鉴定的阳性克隆送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.10 序列同源性分析

应用DNAman和DNAStar生物软件对基因序列与GenBank上登录的国内外有代表性的布氏杆菌相应序列进行同源性分析、比对，分析其序列特征。

2 结 果

2.1 菌体染色

布氏杆菌革兰染色为阴性(红色)，呈球杆状细菌，单个或多个存在，见图1。

2.2 布氏杆菌试剂盒检测

使用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的布氏杆菌快速实时荧光PCR试剂盒(图2)和布氏杆菌PCR试剂盒(图3)对7份样品进行检测，结果显示，快速荧光试剂盒检测7份样品均为阳性，普通PCR试剂盒检测7份样品中5份阳性，2份阴性。结果见表4、图2和图3。表4为快速荧光试剂盒检测Ct值，可知眼分泌物病菌含量高于阴道分泌物和尿液中的病菌含量。

图1 布氏杆菌感染犬分泌物染色(915×)Fig.1 Staining of secretion from Brucella infected pet dogs (915×)

1～7. 样品编号；8. 阳性对照；9. 阴性对照1-7. Sample number；8. Positive control; 9. Negative control图2 布氏杆菌快速荧光试剂盒结果Fig.2 Detection results of Brucella rapid fluorescent reagent kit

表4 布氏杆菌快速荧光试剂盒检测Ct值

Table 4 Result ofCtvalues byBrucellarapid fluorescent reagent kit

犬品种Dogspecies样品编号Samplenumber样品来源SamplesourceCt值Ctnumber结果Results斗牛犬(母)1眼鼻分泌物27．43阳性2阴道分泌物33．61阳性斗牛犬(公)3眼鼻分泌物33．83阳性4阴茎分泌物37．29阳性泰迪(母)5眼鼻分泌物25．28阳性6阴道分泌物29．57阳性7尿液37．75阳性

1～7. 样品编号；8. 阳性对照；9. 阴性对照；M. DL2000 DNA相对分子质量标准1-7. Sample number; 8. Positive control; 9. Negative control; M. DL2000 DNA marker图3 布氏杆菌PCR试剂盒检测结果Fig.3 Results of Brucella PCR kit

2.3 Multi-PCR 鉴定

用两种Multi-PCR对样品1和样品5进行扩增，牛羊猪犬Multi-PCR结果显示两个样品均能扩增出272 bp的片段，为犬种布氏杆菌，结果见图4。典型非典型Multi-PCR结果显示能扩增出436和217 bp的片段，为非典型犬布氏杆菌，结果见图5。

1.样品1；2. 样品5；3. 疫苗株S2对照; 4. 阴性对照；M. DL2000 DNA相对分子质量标准1.Sample 1; 2. Sample 5; 3. Control of Vaccine S2 strain; 4. Negative control; M. DL2000 DNA marker图4 牛、羊、猪、犬布氏杆菌Multi-PCR 检测Fig.4 The detection of Multiplex PCR for Brucella abortus, Brucella meltitensis, Brucella suis and Brucella canis

1.阴性对照；2. 样品1；3. 样品5；M. DL2000 DNA相对分子质量标准1. Negative control; 2. Sample 1; 3. Sample 5; M. DL2000 DNA marker图5 典型和非典型布氏杆菌Multi-PCR结果Fig.5 The results of Multi-PCR for Typical and Atypical B. canis

2.4 基因序列扩增

用16S rRNA引物、OMP25引物和BSCP引物从样品1和样品5 的DNA中扩增相应基因序列，结果显示，均获得大小合适的目的条带：16S rRNA大小约为1 400 bp，BSCP大小约为1 000 bp，OMP25约为650 bp。结果详见图6。

1.样品1；5. 样品5；M. DL2000 DNA相对分子质量标准1. Sample 1；5. Sample 5；M. DL2000 DNA marker图6 基因序列扩增Fig.6 Amplication results of genes

2.5 基因序列测序及分析

测序结果显示，样品1(来自进口斗牛犬)和样品5(来自泰迪犬)16S rRNA、OMP25和BSCP分别长1 426、652和1 034 bp，核苷酸相似性均为100%。将样品5的16S rRNA、OMP25和BSCP基因序列提交到GenBank，登录号分别为KX529832、KX529833和KX529834，将该菌株命名为YH-C16。OMP25基因序列与我国内蒙古分离的xue1分离株和韩国BrucellacanisHSK A52141分离株关系最为亲近，相似性为99.9%，有两个核苷酸发生改变，但氨基酸没有改变。16S rRNA 基因序列分析显示，本次感染的菌株属于布氏杆菌。BSCP31基因测序显示，两个菌株与NCBI上代表性的菌株相似性均在99%以上，其中与BrucellasuisSPC 株、BrucellacanisRM6/66株、SVA13株以及ATCC23365等菌株核苷酸相似性为100%。

3 讨 论

2016年1月，我单位收到关忠动物医院送检的两例疑似布病感染的7份样品，对其分别用布氏杆菌快速实时荧光PCR和布氏杆菌PCR试剂盒进行检测；快速实时荧光PCR检测试剂盒检测两例犬的7份分泌物均为布氏杆菌阳性，普通PCR检测试剂盒检测7份样品中5份阳性，2份阴性，其中眼分泌物病菌含量最高，其次是阴道分泌物，尿液中病菌含量最低。为对感染布氏杆菌进一步鉴定确诊，复采取Multi-PCR和序列测序的方法对样品1和样品5进行鉴定。Multi-PCR表明两份样品均为犬种布氏杆菌感染，且为非典型布氏杆菌，这与患犬临床症状和测序结果相符(OMP25 基因序列与犬种分离株xue1相似性最高)。16S rRNA、OMP25和BSCP31基因序列比对结果显示，布氏杆菌16S rRNA、OMP25、BSCP31等基因和NCBI基因库里的基因序列相似性均在99%以上，这说明布氏杆菌菌株之间、种属之间序列差异不大。

16S rRNA为原核生物的一种核糖体RNA。由于其基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具[3]。但也存在一些问题，比如水平基因转移、多拷贝的异质性、基因扩增效率的差异等[5-6]。本研究对16S rRNA序列进行扩增，并扩增出了大小与目的片段大小相符的目的DNA。OMP25是OmpA家族成员之一，是布氏杆菌重要的外膜蛋白，在维持细菌外膜结构稳定中发挥重要作用[7-8]，此外，OMP25还与布氏杆菌的毒力有关[9]。BSCP31是布氏杆菌表面蛋白，基因序列非常保守，目前其功能还不是很清楚，但基因缺失研究表明BSCP31并不影响细菌侵袭力和生长速度[10]。本次扩增的OMP25和BSCP31序列，和犬布氏杆菌相应序列相比，相似性在99%以上，与狄栋栋[2]和丁家波[11]报道的一致。

目前PCR技术多用于人类布病的检测，对于动物布病这一方法尚未列入我国布病标准检测方法中。本研究从布氏杆菌试剂盒检测、Mutil-PCR种属鉴定和基因测序等方面对疑似感染布氏杆菌犬进行了鉴定，确诊了北京地区存在宠物犬感染布氏杆菌的病例，结果也进一步证实了布氏杆菌检测试剂盒的可靠性和准确性。本研究为以后布氏杆菌病的检测提供了很好的工具，也为布氏杆菌病的筛查以及防控提供了依据。

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(编辑 白永平)

PCR Detection and Partial Sequencing Analysis of Brucella canis from Pet Dogs

SUN Ming1，LIU Qiao-rong1，SONG Wen-jing2，QIAO Ming-ming1，GU Qiang2,ZHANG Qian1，LIU Bo-hua1，YANG Xue-song2，CHEN Xi-zhao1*

(1.Beijing Anheal Laboratories Co., Ltd, Beijing 100094, China;2.BeijingGuanZhongAnimalHospital,Beijing100025,China)

Two cases of pet dogs were confirmed to be infected withBrucellacanisbased on detection to their excretion by use of the BRU real time PCR and conventional PCR kits, and the partial genetic sequences of theBrucellacanisinfected were characterized. The results showed that theBrucellastrains from the pet dogs belong to theBrucellacanis, and atypical canine brucellosis. Phylogenetic analysis of BSCP31 gene sequences showed 99%-100% nucleotide identity with the published sequences in GenBank, andOMP25 gene showed 99.9% nucleotide identity betweenBrucellacanisxue1 strain andBrucellacanisHSK A52141 strain. Sequence analysis on 16S rRNA showed the strains from French Bulldog and Teddy Dog belong toBrucella. These data might provide a valuble infomation for future screening and prevention of canine brucellosis.

Brucella; pet dogs; PCR detection; sequence analysis

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.12.023

2016-06-16

“十三五”国家重点研发计划(2016YFD0501006)

孙 明(1963-)，男，河北秦皇岛人，博士，主要从事分子病毒诊断技术研究，E-mail：sunming@anheal.com

*通信作者：陈西钊，博士，研究员，主要从事动物传染病与预防兽医学研究，E-mail：chenxizhao@anheal.com

S852.612

A

0366-6964(2016)12-2520-06