雌激素通过ER-α调控CYP2C8在鸡肝中的表达

李艳敏，李翠翠，郑 航，田方圆，王台安，田亚东，李转见，康相涛，刘小军

(河南农业大学牧医工程学院，河南省家禽种质资源创新工程研究中心，河南省家禽育种国际联合实验室，郑州 450002)

雌激素通过ER-α调控CYP2C8在鸡肝中的表达

李艳敏，李翠翠，郑 航，田方圆，王台安，田亚东，李转见，康相涛，刘小军*

(河南农业大学牧医工程学院，河南省家禽种质资源创新工程研究中心，河南省家禽育种国际联合实验室，郑州 450002)

本研究旨在探讨鸡CYP2C8基因的表达调控规律。采集30周龄卢氏绿壳蛋鸡心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腹脂、肌胃、腺胃、卵巢、胰、十二指肠、空肠、回肠14种组织以及从1日龄～30周龄不同发育时期的肝组织，用荧光实时定量PCR分析CYP2C8基因的时空表达规律；用雌激素及其受体拮抗剂对活体和体外培养的鸡胚肝原代细胞进行处理，用荧光实时定量PCR分析CYP2C8基因的表达调控机制。结果表明，鸡CYP2C8基因在各组织中表现出广泛表达的特性，但在脂类代谢旺盛的器官如肝、肾、小肠(十二指肠、空肠、回肠)等器官中表达较高，且在肝中的表达水平随着性成熟而显著升高(P<0.01)；雌激素处理可显著提高鸡肝组织和体外培养的鸡胚胎肝原代细胞中CYP2C8的表达水平(P<0.05)，但雌激素受体ER-α拮抗剂MPP可完全抑制雌激素的作用(P<0.05)。综上表明，鸡CYP2C8基因在不同组织中广泛表达，而以肝中的表达水平最高，且肝中CYP2C8基因的表达是受雌激素并通过ER-α调控。

肝；CYP2C8基因；表达调控；雌激素

细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450或P450)是一组含血红素的蛋白质，由结构和功能相关的基因超家族编码形成的超家族酶系[1]，因还原型CYP450蛋白与一氧化碳复合物在450 nm处有特异性吸收峰而得名[2]。CYP2C8基因是P450家族的重要成员[3]，哺乳动物的研究表明，CYP2C8基因在肾、肺、鼻黏膜、内皮黏膜、心都有表达，但肝组织表达最高[4-7]，主要参与体内药物代谢[8-11]，如人CYP2C8基因主要参与体内抗糖尿病药物罗格列酮和曲格列酮、抗癌药物紫杉醇、降胆固醇药物西立伐他汀等的代谢[11]和内源性分子花生四烯酸到环氧化二十碳三稀酸(Epoxyeicosatrienoic acids,EETs) 等的代谢[12]。

PPARα是PPAR转录因子的一个亚型，是一种营养传感器，能调节脂肪酸的代谢，影响脂肪生成和酮体合成[13]。鸡PPARα基因在肝、心、肾和尾脂腺组织中表达量较高[14]，而熊敏等[15]在初生肉鸡中研究表明PPARα只在肝中表达，推测其在初生肉鸡肝脂肪代谢中起重要的作用，然而CYP2C8基因作为PPARα新靶基因[16]，笔者推测其可能参与家禽调控脂质代谢。

通过对产蛋前期母鸡(20周龄)和产蛋高峰期母鸡(30周龄)肝组织转录组数据分析发现，CYP2C8基因的表达水平在产蛋高峰期鸡肝组织显著升高[17]，表明CYP2C8基因在产蛋期母鸡肝代谢中可能发挥重要的生理功能。由于产蛋期母鸡肝需要合成大量的低密度脂蛋白(VLDL)及卵黄前期物(VTG)等脂类物质[18]，产蛋鸡肝的代谢活动多与脂质代谢有关，而且这一过程一般认为受雌激素调控[19]。而有关CYP2C8基因在鸡的时空表达规律及其表达调控机制迄今未见报道。本研究将分析CYP2C8基因在不同组织和不同生长阶段的表达模式，同时探讨其在雌激素诱导下的表达调控规律，为进一步阐明CYP2C8基因在产蛋期母鸡肝脂质代谢中的生物学功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验动物及样品采集

选取不同发育时期(1日龄、1周龄、10周龄、15周龄、20周龄和30周龄)体重相近的健康河南省优良地方鸡品种卢氏绿壳蛋鸡各6只，颈部放血处死后，采集心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腹脂、肌胃、腺胃、卵巢、胰、十二指肠、空肠、回肠14种组织，于液氮速冻后，-80 ℃保存备用。选取体重相近的健康10周龄的海兰褐蛋鸡70只，随机分为4组，前3组中每组20只，各组分别按0.5、1.0和2.0 mg·kg-1体重肌肉注射溶于无水乙醇的3种不同浓度的17β-雌二醇(Sigma，美国)，第4组10只鸡为对照组，注射等量的溶剂。各试验组在17β-雌二醇注射12 h后随机挑选10只鸡，颈部放血处死，采集肝组织，于液氮速冻后保存于-80 ℃备用。各试验组剩余个体在17β-雌二醇注射24 h后与对照组一起，采用与上述同样的方法处死，采集并保存样品。

1.2 鸡胚肝原代细胞的分离与培养

购自于北京梅里亚维通试验动物技术有限公司SPF种蛋消毒后，置于温度38 ℃，湿度97%条件下孵化，孵化过程中自动翻蛋。孵化至17胚龄时取出，用酒精消毒后，打开蛋壳钝端并揭开气室膜，于超净台中取出鸡胚，打开鸡胚腹腔，取出肝，用D-Hank’s溶液进行清洗，并剔除非肝组织部分，然后移入加有D-Hank’s的烧杯中，用手术剪将肝组织剪成1 mm3的小块，随后加入0.1%的胶原酶IV进行消化，待消化完成后，用100目、500目细胞筛过滤，取过滤后的细胞悬液，1 000 r·min-1，5 min离心3次细胞悬液，吸取上清液，加入Williams’E培养液重悬，采用Percoll梯度离心法纯化肝细胞，将纯化后的肝原代细胞用含胎牛血清的Williams’E培养液重悬，采用台盼兰染色法进行细胞计数，按5×105个·mL-1种植于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养；12 h后更换培养基，去除未贴壁的杂细胞和细胞碎片，待细胞生长到80%融合时，更换为无血清的基础培养基饥饿处理6 h，然后用不同浓度的17β-雌二醇(1、50、100 mg·L-1)、MPP(100 mg·L-1)、 ICI 182,780、Tamoxifen(100 mg·L-1)(均购自Sigma，美国)单独或混合处理细胞，24 h后收集细胞，-80 ℃保存。

1.3 总RNA的提取与反转录

参照RNAiso Plus(TaKaRa)说明书提取组织和细胞RNA，-80 ℃保存备用。参照PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)试剂盒方法进行反转录合成cDNA，-20 ℃保存备用。

1.4 引物设计与合成

参照Ensemble中鸡CYP2C8(ENSGALG-000000 26793)和NCBI中β-actin(MGL-1_205518.1)、ApoVLDLII(MGL-1_205483.2)基因mRNA序列，利用Primer5.0软件设计PCR引物(表1)，退火温度为60 ℃，由上海生工生物有限公司合成。

表1 PCR引物序列及扩增片段的大小

Table 1 The Primer sequences and Product size for PCR

基因Gene引物序列(5′→3′)Primersequence产物长度/bpLengthCYP2C8F：GTTTGCAGGTCCCAGTTCAG，R：TCCTTCCCTCTTTGCGATGT152β⁃actinF：CAGCCAGCCATGGATGATGA，R：ACCAACCATCACACCCTGAT118ApoVLDLIIF：CAATGAAACGGCTAGACTCA，R：AACACCGACTTTTCTTCCAA108

1.5 实时荧光定量PCR

根据QuantiFastSYBR GreenPCR的试剂盒的操作说明，以β-actin为内参，用实时荧光定量PCR检测CYP2C8基因的表达量，同一反应重复3次。实时荧光定量PCR体系为2×QuantiFastSYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL,用RNase-Free水补足到20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40循环。

1.6 数据分析

采用2-ΔΔCt方法分析基因的相对表达量，应用SPSS20.0软件进行单因素方差分析，比较不同组织、不同发育时期基因的表达水平，P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。图中数据用“平均值±标准差”表示(图1除外)。

2 结 果

2.1 鸡CYP2C8基因在不同组织中的表达规律

将各组织6个个体的cDNA样品等量混合，以β-actin为内参，用荧光实时定量PCR分析表明，鸡CYP2C8基因在心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腹脂、肌胃、腺胃、卵巢、胰脏、十二指肠、空肠、回肠等组织中均有不同程度的表达，尤其在脂类代谢旺盛的器官如肝、肾、小肠(十二指肠、空肠、回肠)等器官中表达水平较高，且以肝的表达水平最高(图1)。

图1 鸡CYP2C8基因在30周龄个体不同组织中的相对表达量Fig.1 The relative expression level of CYP2C8 gene in different tissues of chicken at 30 weeks old

2.2 鸡CYP2C8基因在肝组织中的时序表达规律

对1日龄、1周龄、10周龄、15周龄、20周龄、30周龄6个发育阶段肝组织(n=6)中CYP2C8基因的荧光实时定量PCR分析发现，产蛋高峰期(30周龄)母鸡肝中CYP2C8基因的表达量极显著高于产蛋前期(20周龄以前)母鸡(P<0.01)肝中CYP2C8基因的表达量(图2)。

不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同Different uppercase letters means very significant difference between groups (P<0.01),the same letter mean no significant difference between groups(P>0.05). The same as below图2 不同发育时期鸡肝组织中CYP2C8基因的表达规律Fig.2 The relative expression level of CYP2C8 gene in liver of chicken in different development stages

2.3 雌激素处理对血液指标和鸡肝内CYP2C8基因表达的影响

2.3.1 雌激素处理对血液指标的影响 雌激素是产蛋期母鸡肝脂质代谢的主要诱导因子[19-20]，不同浓度的17β-雌二醇(0.5、1.0和2.0 mg·kg-1)处理10周龄青年母鸡12 h后，与对照组相比，血清中的TG含量显著升高(P<0.05)，TC的含量只在1.0 mg·kg-1组显著升高(P<0.05)，VLDL-c无显著变化(P>0.05)；雌激素处理24 h，血清中的TG、 TC和VLDL-c的含量在1.0和2.0 mg·kg-1组显著升高(P<0.05)(图3)。

2.3.2 雌激素处理对鸡肝CYP2C8基因表达的影响ApoVLDLII基因启动子区含有典型的雌激素受体结合位点(ERE)[26-27]，可作为生物体对雌激素反应的标记基因。不同浓度的17β-雌二醇(0.5、1.0和2.0 mg·kg-1)处理10周龄青年母鸡12和24 h后，与对照组相比，雌激素反应的标记基因ApoVLDLII的表达水平都成剂量依赖性显著升高(P<0.05)(图4A, B)，表明17β-雌二醇发挥其正常生理功能。同时，17β-雌二醇处理12 h后，各试验组中CYP2C8基因的表达水平与对照组相比也显著升高(P<0.05)(图4C)；17β-雌二醇处理24 h后，1.0和2.0 mg·kg-1组CYP2C8基因的表达水平显著高于对照组(P<0.05)，但0.5 mg·kg-1组CYP2C8基因的表达水平与对照组差异不显著(P>0.05)(图4D)。

A.12 h；B.24 h。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同A.12 h; B.24 h. Different small letters list means significant difference (P<0.05), the same letter show no significant difference between treatments(P>0.05). The same as below图3 雌激素处理的鸡血清中TG、TC和VLDL-c的浓度Fig.3 The concentrations of TG,TC and VLDL-c in different estrogen treatment in chicken serum

2.4 雌激素处理对鸡胚肝原代细胞中CYP2C8基因表达的影响

2.4.1 鸡胚肝原代细胞形态观察 刚分离(0 h)的鸡胚肝原代细胞成圆形，细胞单个或数个聚集分布在培养基。培养4 h后鸡胚肝原代细胞开始贴壁。培养24 h后，细胞呈多角形，细胞聚集成岛屿状生长，排列整齐、形似梅花(图5)。

A，C.12 h;B,D.24 h图4 不同浓度雌激素处理10周龄母鸡对肝组织中ApoVLDL II(A、B)和CYP2C8(C、D)基因表达的影响Fig.4 Effects of different doses of 17β-estradiol on the expression of ApoVLDL II (A,B) and CYP2C8 (C,D) genes in the liver of 10 weeks old pullets after they were treated

A.0 h；B.24 h图5 鸡胚肝原代细胞生长状态Fig.5 The growth state of primary chicken hepatocytes

2.4.2 雌激素处理对鸡胚肝原代细胞中CYP2C8基因表达的影响 不同浓度雌激素处理体外培养的鸡胚肝原代细胞24 h后，与对照组相比，雌激素反应的标记基因ApoVLDLII的表达水平都成剂量依赖性显著升高(P<0.05)(图6A)，表明17β-雌二醇发挥其正常生理功能。CYP2C8基因的表达水平在50和100 mg·L-1浓度处理组显著高于对照组(P<0.05)(图6B)。

2.5 雌激素受体拮抗剂处理对鸡CYP2C8基因表达的影响

不同类型的雌激素受体拮抗剂与雌激素共同处理体外培养的鸡胚肝原代细胞24 h后CYP2C8基因的表达水平变化见图7。CYP2C8基因的表达水平在雌激素单独处理组显著高于对照组(P<0.05)。雌激素分别与MPP、ICI 182,780和Tamoxifen共处理体外培养的鸡胚肝原代细胞时，各组间CYP2C8基因的表达水平与对照组相比无显著变化，但与雌激素单独处理组相比则显著下调(P<0.05)。因为MPP是ER-α的高度选择性拮抗剂[32]，ICI 182,780和Tamoxifen主要是ER-α和ER-β受体的拮抗剂，且Tamoxifen对GPR30还表现出高亲和力[33]，仅添加MPP时，雌激素处理组中CYP2C8基因的相对表达量恢复到对照组(正常细胞，无雌激素处理)相同的水平，说明ER-α拮抗剂可使雌激素完全不能发挥作用，当添加ICI 182,780时，雌激素处理组中CYP2C8基因的相对表达量与对照组和ER-α特异性拮抗剂处理组没有差异，表明同时阻断ER-α，ER-β受体的作用并不能使CYP2C8基因的相对表达量进一步下降，说明雌激素对CYP2C8基因表达的调控主要通过ER-α介导而实现。综上表明，雌激素对CYP2C8表达的调控主要是通过ER-α介导实现。

图6 ApoVLDLII(A)、CYP2C8(B)在不同雌激素处理的肝原代细胞中的表达量Fig.6 The expression difference of ApoVLDL II(A),CYP2C8(B) in different estrogen treatment in hepatocytes

图7 雌激素受体拮抗剂MPP、ICI 182, 780(ICI)和Tamoxifen(Tam)与雌激素共处理肝细胞对CYP2C8基因表达的影响Fig.7 Effects of co-treatment of E2 and the ER antagonists ICI 182, 780(ICI), tamoxifen (Tam), and MPP on the expression of CYP2C8 mRNA in hepatocytes

3 讨 论

基因的表达特性与它们在生物体生长发育过程中的功能紧密相关，因此研究基因在不同组织和不同发育阶段的表达规律是研究其功能的基础。本研究对CYP2C8基因在30周龄卢氏绿壳蛋鸡14种组织的表达分析表明，CYP2C8基因在家禽脂类代谢旺盛的组织器官如肝、肾、小肠(十二指肠、空肠、回肠)[21]等的表达水平较高，且肝的表达水平最高，从而推断CYP2C8基因可能参与产蛋期鸡脂类代谢过程。这与有关CYP2C8基因在人的肝组织较高表达的研究[4-7]结果一致。

进一步对CYP2C8基因在不同生理期的卢氏绿壳蛋鸡肝组织的时序表达分析表明，CYP2C8基因在产蛋前鸡(1日龄～20周龄)肝组织表达水平较低,而在产蛋高峰期(30周龄)显著升高达10倍左右。与产蛋前期母鸡相比，产蛋期母鸡最明显的生理变化是肝脂肪和蛋白代谢显著加强，合成胚胎发育所需要的营养物质，转运到生长的卵母细胞形成蛋黄。CYP2C8基因在产蛋期母鸡肝组织表达的显著升高，进一步表明CYP2C8基因可能参与产蛋期鸡脂类代谢过程。

产蛋期母鸡体内脂类代谢是受激素调控的[22-24]。已有的研究表明，血清中雌激素水平随着性成熟逐步升高，21周龄产蛋母鸡血清中雌激素水平比6周龄青年母鸡血清中雌激素水平升高450%[25]。为了进一步研究雌激素对CYP2C8基因表达调控的关系，构建了雌激素诱导的个体和鸡胚肝原代细胞模型。由于ApoVLDLII基因启动子区具有典型的雌激素反应元件(Estrogen response element ，ERE)[26-27]结合位点，其表达直接受雌激素的调控，因此被作为雌激素作用效应的标记基因。本研究中，10周龄青年母鸡经不同浓度雌激素处理12 h后，ApoVLDLII基因和CYP2C8基因的表达水平均显著升高，血清中的TG和TC含量也显著升高，但VLDL-c无显著变化；处理24 h后，与对照组相比，ApoVLDLII基因的表达水平仍保持显著高的水平，CYP2C8基因的表达水平以及血清中的TG、TC和VLDL-c含量却只在1.0和2.0 mg·kg-1浓度处理组显著高于对照组。1.0 mg·kg-1处理24 h是研究雌激素诱导的肝脂肪代谢较为适合的浓度和时间点。同样，不同浓度的雌激素处理肝原代细胞24 h后，与对照组相比，ApoVLDLII基因的表达水平均显著升高，但CYP2C8基因的表达水平只有在浓度为50 和100 mg·L-1处理组显著高于对照组，因此，50 mg·L-1是雌激素处理细胞24 h的合适浓度。

选择性雌激素受体激动剂和拮抗剂是除基因敲除外另一个研究受体功能的常用方法[28-29]，其中特异性拮抗剂能够阻断雌激素受体的作用，从而抑制雌激素对靶基因的作用。雌激素受体属于核受体超家族中的成员，是一类由配体激活的转录因子[30]，主要包括核受体ER-α和ER-β，以及G蛋白耦联受体30(GPR30)。雌激素的生物学功能主要通过ER-α、ER-β和GPR30介导实现的，如李军等研究发现雌激素能够通过核受体ER-α诱导鸡肝生成ApoVLDLII和VTG2[31]。研究表明，MPP是ER-α的高度选择性拮抗剂[32]，ICI 182,780和Tamoxifen主要是ER-α和ER-β受体的拮抗剂，且Tamoxifen对GPR30表现出高的亲和力[33]，在人和石首鱼的研究中表现出相当于雌二醇的活性。为了进一步研究雌激素对CYP2C8基因的调控机制。本试验以3种雌激素拮抗剂MPP、ICI 182,780 和Tamoxifen分别与雌激素共同处理鸡胚胎肝原代细胞，分析不同类型拮抗剂对CYP2C8基因表达的影响，结果表明，雌激素调控鸡CY2CC8基因的表达是通过ER-α介导的。

雌激素通过雌激素受体发挥生理作用的方式主要有3种：一是通过激活雌激素受体后，直接与靶基因启动子区域的雌激素受体反应元件(ERE)结合，并募集辅调控因子，形成转录起始复合物，从而顺式激活靶基因调控区的增强子，促进靶基因的转录。二是通过结合或激活其他可直接结合DNA的转录因子来间接调控基因的转录，如激活蛋白AP-1、特异蛋白SP-1、P53等[34]。三是雌激素可通过膜受体介导快速的非基因型效应，激活细胞内的第二信使，间接调控一系列基因转录[35]。关于雌激素激活ER-α后具体是通过哪种信号转导途径调控鸡CYP2C8基因表达的，还有待进一步研究。

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(编辑 程金华)

Expression of CYP2C8 Is Regulated by Estrogen through ER-α in Liver of Chicken

LI Yan-min, LI Cui-cui, ZHENG Hang, TIAN Fang-yuan, WANG Tai-an,TIAN Ya-dong, LI Zhuan-jian, KANG Xiang-tao,LIU Xiao-jun*

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University,HenanInnovativeEngineeringResearchCenterofPoultryGermplasmResource,InternationalJointResearchLaboratoryforPoultryBreedingofHenan,Zhengzhou450002,China)

The objectives of the present study were to investigate the characteristics of expression and regulation ofCYP2C8 gene in chicken. A total of 14 tissues (including heart, liver, spleen, lung, kidney, pectoral muscle, abdominal fat, gizzard, glandular stomach, ovaries, pancreas, duodenum, jejunum and ileum) were collected from Lushi green-shelled-egg chickens at the age of 30 weeks old, and the liver tissues were obtained from the chickens at different development stages (from the age of 1 day to 30 weeks old) . The samples were used to detect the spatiotemporal expression profiles ofCYP2C8 gene using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) technology. In addition, the pullets (at the age of 10 weeks old) which were treated with 17β-estradiol, and chicken embryo primary hepatocytes which were treated with either 17β-estradiol alone or combination of 17β-estradiol and estrogen receptor (ER) antagonists were used to analysis the expression regulation mechanism of theCYP2C8 gene. The results showed thatCYP2C8 gene was expressed extensively in different tissues of chicken. The relative expression level ofCYP2C8 was higher in the main lipid metabolism tissues such as liver, kidney, and small intestine (duodenum, jejunum and ileum) than that in other tissues. The expression level ofCYP2C8 gene in liver of hens was significantly increased with the sexual maturity (P<0.01). Estrogen could significantly up-regulate the expression ofCYP2C8 in liver of chicken and hepatocytes (P<0.05). MPP, as an ER-α specific antagonist, could completely antagonize the expression ofCYP2C8 gene (P<0.05). Therefore we concluded thatCYP2C8 gene was expressed extensively in different tissues with higher expression levels in liver, kidney, and small intestine (duodenum, jejunum, and ileum) tissues, and the highest expression level in liver. It was suggested that the effect of estrogen on the expression ofCYP2C8 gene was predominantly mediated via ER-α in the chicken liver.

liver;CYP2C8 gene; expression regulation; estrogen

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.12.005

2016-06-06

河南省国际合作项目(162102410030)；地方鸡种质资源保护与利用教育部创新团队发展计划(IRT1236)；国家蛋鸡产业技术体系遗传育种岗位专项资金(CARS-41-K04)

李艳敏(1989-)，女，河南尉氏人，硕士生，主要从事动物遗传育种研究，E-mail：15138656629@163.com

*通信作者：刘小军，教授，主要从事动物遗传育种研究，E-mail：xjliu2008@hotmail.com

S831.2

A

0366-6964(2016)12-2362-08