影响牙周膜干细胞生物学特性的生物学因素*

杜婷婷 刘 娜 张 彤

影响牙周膜干细胞生物学特性的生物学因素*

杜婷婷 刘 娜 张 彤

牙周膜干细胞(PDLSC)存在于牙周膜组织中，是一种具有高度增殖、自我更新能力和多向分化能力的间充质干细胞，在维持牙周组织动态平衡和缺损修复的过程中发挥重要作用，被认为是牙周组织工程和再生医学的关键种子细胞之一。近年来的研究发现，多种因素可调节其干细胞特性，本文结合近年来国内外文献对影响牙周膜干细胞生物学特性的生物学因素作一叙述，并展望其在未来干细胞治疗中的应用前景。

牙周膜干细胞；增殖能力；分化能力

牙周膜位于牙槽骨与牙骨质之间，将牙齿稳固的固定在牙槽窝中，是维持牙周组织稳定的重要因素。2004年，Seo等[1]通过单细胞克隆技术首次证实了牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSC)存在于牙周膜中，并发现其在特定的培养条件下可分化成为成牙本质细胞、脂肪细胞以及胶原形成细胞。近年来的研究证明其有较强的增殖能力、自我更新能力和多向分化潜能，在不同的诱导条件下可分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞及神经细胞等多种不同的细胞，生理因素、病理因素、外源性因素等多种因素均可调节其增殖、分化能力，然而不同因素对其生物学特性有不同影响。深入研究这些影响因素不仅有助于在PDLSC的应用中更好地发挥其优势，避免其不利因素，而且对于今后基于PDLSC的牙周组织修复及再生具有指导意义，以期在组织再生应用中达到较好的治疗效果。目前的研究证实, 影响PDLSC生物学特性的生物学因素主要有以下几方面：

1.牙周膜组织来源对PDLSC生物学特性的影响

1.1牙槽窝来源的PDLSC 已有研究表明牙根表面的牙周膜中有PDLSC的存在,而PDLSC可能因其存在部位的不同而存在性质上的差异。目前的研究中关于PDLSC的获取主要采自根中1/3部分。然而，动物实验与人体实验均证实牙槽窝内也可分离出PDLSC。Wang等[2]拔除SD大鼠磨牙后，通过HE染色观察到牙根表面及牙槽窝内均有牙周膜组织，获取牙槽窝来源的牙周膜组织后分离出PDLSC，检测其干细胞生物学特性,并与牙根表面来源的牙周膜干细胞和其骨髓间充质干细胞(BMSC)作比较,分析两部分来源牙周膜干细胞性质的差异。结果发现，PDLSC在牙周膜中的分布具有不对称性,相比牙根表面侧，靠近牙槽窝侧PDLSC更多，并且牙槽窝来源的PDLSC增殖与成骨分化及成脂分化能力均强于牙根表面侧。将其与CBB复合包裹纤维蛋白胶,植入裸鼠背部皮下,结果显示其形成的矿化面积也多于牙周膜侧PDLSC，且矿化组织的形态更接近于骨髓间充质干细胞(BMSC)的生成物。Wang等[2]关于人牙周膜干细胞的研究表明，牙齿拔除后仍有部分牙周膜组织存在于牙槽窝内，与牙周膜侧获得的PDLSC相比，从牙槽窝骨源细胞分离出的PDLSC具有较高的增殖能力，其间充质标记物的表达更高，并具有更强的成骨和成脂分化潜能，此外，其介导的牙周组织再生结果显示，来源于牙槽窝的PDLSC介导完成的牙槽骨重建更好。

1.2乳牙牙根来源的PDLSC 近年来，乳牙来源的PDLSC也日益受到关注[3-5]。研究发现，乳牙PDLSC也来源于间充质干细胞，在形态上与恒牙PDLSC相似，均为长梭形成纤维细胞样，但其PDLSC较恒牙PDLSC略小[6]。此外，与恒牙相比，乳牙PDLSC的增殖能力更强，其克隆形成率高于恒牙，这可能与其供体年龄较小有关。与恒牙PDLSC相同，乳牙PDLSC也具有多向分化能力，但其分化潜能与其牙根吸收情况密切相关。有学者获取因滞留而拔除的不同根吸收阶段的乳前牙，通过用酶组织块消化法分离培养其牙根表面牙周膜来源的PDLSC，对比其生物学特性发现，牙根中度吸收的乳牙PDLSC成脂分化能力较牙根重度吸收者强，而成骨分化能力则明显较重度吸收者弱[7]。早有研究证实，骨随间充质干细胞(Bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSC)的成骨分化与成脂分化二者之间存在着此消彼长的平衡[8]，这也从另一方面揭示了不同牙根吸收阶段的乳牙PDLSC具有不同的多向分化能力的原因。此外，牙根的生理性吸收过程中PDLSC成骨分化与成脂分化能力的改变可能对根吸收破骨活性的变化造成一定的影响，或者由于牙根吸收造成了PDLSC多向分化能力的变化[7]。

1.3恒牙牙根来源的PDLSC 供体年龄对PDLSC的生物学特性也有影响。来自不同发育阶段的恒牙牙根PDLSC的研究证实，PDLSC 的增殖能力与成牙及成骨分化能力与恒牙牙根发育阶段密切相关，随着牙根逐渐发育完全，PDLSC的增殖能力与成牙及成骨分化能力均下降，这种影响可能与牙根不同发育阶段牙根周围的微环境变化有关[9]。有学者认为，PDLSC在牙根发育期处于一种更为“年轻”的微环境当中，类似于干细胞“龛”(stem cell niche)，此微环境中包括细胞、细胞因子、胞外基质、信号分子及细胞间相互作用等多种因素，而其呈现出的细胞浓聚现象则有利于细胞间及细胞与基质间的相互作用，从而在此微环境中产生更多的信号分子等促进细胞间交通的成分[10]。而此交通成分在牙齿形态发生的时间与空间上起着关键的调节作用[11]，因而不同牙根发育阶段的恒牙其增殖、分化能力产生了差异。

Zheng等[12]通过比较不同年龄阶段恒牙PDLSC的生物学特性发现，随着年龄长,PDLSC的增殖能力、克隆形成能力、成骨分化能力以及相关的基因表达均有所下降。Zhang等[13]的研究发现，PDLSC的增殖、分化能力和细胞迁移能力均随供体年龄的增加而降低。老年组(41岁以上)细胞表达STRO-1 和CD146比年轻者少，体内未能形成牙骨质牙周膜样结构，表明PDLSC的数量和再生能力随着供体年龄的增加而降低。此外，Wu等[14]的研究也发现PDLSC的增殖、成骨分化能力及其多能性相关转录因子的表达均显示出年龄相关的下降。而且其衰老相关的SA-βG表达随年龄增加而增加，形成的细胞膜片形态学观察和ki-67免疫组织化学染色均显示，衰老PDLSC的细胞形成功能受损。此外，研究表明，将来源于年轻个体PDLSC的条件培养液作用于年老个体的PDLSC后，能够恢复年老PDLSC在体内形成牙周组织结构的能力。而老年供体PDLSC条件培养基则抑制年轻供体细胞的再生能力[12]。这一结果不仅表明年龄因素可对PDLSC生物学特性产生不同的影响，而且证实利用微环境模拟年轻个体的条件能够重新给予年老PDLSC组织再生的能力，这为老年患者牙周病或牙周缺损的再生治疗提供了一定的理论基础。

2. 培养方法对PDLSC生物学特性的影响

2.1不同原代培养方法对PDLSC的影响 目前常用的PDLSC原代培养方法有组织块法、酶消化法和酶解组织块法[15]。有学者就这三种方法进行了研究对比，发现组织块法成本低，操作简单，从取材到接种耗时较短，并且能降低组织块的感染几率，从而能提高成功率。酶解组织块法是将组织块法和酶消化法结合，此方法可以减少牙周膜被反复剪切导致的组织块损伤。而在分离纯化PDLSC时，采用有限稀释法对其进行克隆化培养，从混合细胞中分离、纯化PDLSC而需要较高克隆率的研究模型时，酶消化法是首选培养方法[16]。研究证实，采用酶消化法培养PDLSC具有更高的增殖率、集落克隆形成率以及更强的分化能力。此外，用I型胶原酶和中性蛋白酶原代培养PDLSC比用胰蛋白酶和EDTA成功率更高[17]。因此，建议用I型胶原酶和中性蛋白酶来进行原代培养。

2.2培养基的选择 培养基对牙周膜干细胞的生物学特性也有影响。DMEM与a-MEM都广泛用于培养牙周膜干细胞与骨髓间充质细胞。二者都可以维持8代以内的干细胞表型(如STRO-1，CD146，CD105和CD44)的表达。然而，与DMEM相比，a-MEM作为培养基培养的PDLSC具有更强的增殖能力和成骨分化能力。这可能是由于a-MEM培养基含有更多的氨基酸、维生素和核苷酸的原因[18]。因此，a-MEM培养基比DMEM更适合培养PDLSC。

3.不同环境对PDLSC生物学特性的影响

3.1低氧条件 细胞在体外培养时氧气通常维持在20%，干细胞主要聚集在低氧的环境中，低氧是维持干细胞特性的生理微环境[19]。研究发现，PDLSC通过HIF-1α来感知环境中氧张力的变化，HIF-1α既能促进也能抑制细胞的增殖[20]，同时也有学者发现低氧抑制成骨细胞增殖的同时促进其凋亡[21]。研究发现，在2%的氧环境中培养PDLSC后，其多能性标志物的表达(Oct-4、Sox-2和c-Myc)和细胞的分化潜能显著增加[22]，2%氧环境中通过激活p38和ERK1/2信号途径促进PDLSC成骨分化[23]。Hung和Haung[24-25]的研究也均证实，低氧可以促进间充质干细胞的增殖和成骨分化能力。因此，缺氧有利于维持PDLSC的多向分化潜能。邹等[26]的研究发现，1.5%-2.0%的低氧条件下培养牙周膜细胞，分别在12，24，36和48h后检测其增殖能力和表面标志，发现4个时间点牙周膜细胞表面表面CD146 和STRO-1表达水平低氧组与常氧组无差异，然而培养12和24h后低氧组细胞增殖率比常氧组稍高，培养36和48 h后低氧组增殖活性较常氧组降低；表明低氧对牙周膜细胞增殖的影响呈时间依赖性，长期低氧可抑制细胞增殖。

3.2低温冻存PDLSC 在细胞活力最佳时将PDLSC及时冻存，可使其在牙周组织再生的研究步骤有所简化，无需再体外获取PDLSC。Seo等冻存PDLSC后发现，一定温度下冻存，PDLSC的生物学特性均可得到保持，包括其增殖能力、多向分化能力以及形成牙骨质和牙周膜的能力。

徐等[27]用含二甲基亚砜的冻存液超低温冻存人的PDLSC，半年后将其复苏并对其生物学性能进行检测，结果显示PDLSC的增殖分化能力均与对照组无统计学差异，表明深低温保存后PDLSC可继续保持冻存前原有的增殖及多向分化能力。魏等[28]将PDLSC膜片超低温冻存三个月后复苏检测其生物学特性，结果显示冻存PDLSC膜片与新鲜PDLSC膜片的增殖率与成骨和成脂分化能力没有统计学差异，同样表明超低温冻存不会影响人PDLSC的增殖能力及多向分化能力。

4.生长因子对PDLSC 生物学特性的影响

近年来的研究结果发现，多种生长因子对PDLSC的生物学性能也有影响，而且不同的生长因子对其影响不同。

4.1骨形态发生蛋白 Liu等[29]的研究显示，PDLSC的Sox-2和OCT-4的核表达均可维持到其传代至第三代，同时，随着PDLSC传代次数的增加，其SOX-2和OCT-4 mRNA的表达逐渐降低，传至第三代后不再表达。然而，骨形态发生蛋白(BMP-4)不仅能促进细胞增殖，还可以逆转SOX-2及OCT-4表达的降低，甚至可促进其在PDLSC传至第七代时仍表达。由此可知，BMP-4可促进PDLSC在长期培养的过程保持其干性[29]。此外，BMP-2、BMP-7和血管内皮生长因子(VEGF)可促进PDLSC向成骨细胞分化，并促进其在动物模型中骨缺损的修复[29-32]。此外，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)促进PDLSC的增殖，但抑制BMP-2和VEGF在其成骨分化过程中的促进作用。

4.2.转化生长因子 以往的研究发现，转化生长因子(TGF-β1)参与牙周组织的改建，对牙周相关的增殖分化有一定的影响，可以诱导人牙周膜细胞的骨架重排[33]。此外，TGF-β1可促进PDLSC的增殖、迁移和粘附，对PDLSC增殖的促进作用随着浓度的增加而增强，TGF-β1可能通过诱导PDLSC向牙周组织部位迁移并提高其粘附和增殖能力[34]。此外，TGF-β1及其下游蛋白结缔组织生长因子(CTGF)促进PDLSC向成纤维细胞分化。

结果表明，在不同阶段的干细胞可能需要不同类型的生长因子，以促进其增殖或分化。使用生长因子可以有效的改善干细胞的再生，但各种生长因子之间的相互作用目前并不清楚。

5.小结

干细胞疗法是组织工程和再生医学领域研究的热点，通过生物活性因子、干细胞疗法等新的方法促进牙周组织再生已受到广泛关注。牙周组织结构复杂，通过自体干细胞进行牙周治疗是时下的研究热点，而牙周膜干细胞易于获取，增殖分化能力强，可分化为多种不同的细胞，是牙周组织工程的重要种子细胞。而其组织来源，供体年龄，培养方法及条件等因素均对其增殖能力和多向分化能力有较大的影响，关系到其多能性在组织工程中的应用，PDLSC增殖分化过程中易受多种因素的影响，发现并了解这些影响因素，有助于指导我们更好的避开不利因素，根据其特点及治疗要求更好的将其应用于未来的再生医学治疗中。

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Biological factors infl uencing biological characteristics of periodontal ligament stem cells

DU Ting-ting,LIU Na,ZHANG Tong. (Department of stomatology , Chinese PLA General Hospital,Beijing,100853,China)

Periodontal ligament stem cells (PDLSC) exist in the periodontal tissues. As a kind of high proliferation, selfrenewal and multilineage diff erentiation mesenchymal stem cells, they play an important role in maintaining dynamic homeostasis and wound repair of periodontal tissues, and are considered to be one of the crucial type of cells in periodontal tissue engineering and regenerative medicine research. In recent years, it was found that a variety of factors may infl uencethe biological characteristics of periodontal ligament stem cells, In this paper , we reviewed the biological factors on periodontal ligament stem cells with recent literatures, and prospect the future stem cell therapy application prospect.

periodontal ligament stem cells; proliferation capacity; diff erentiation capacity

R781.4

A

1672-2973(2017)01-0046-05

2016-06-15)

国家自然科学基金面上项目(项目编号：51473175)国家自然科学基金(项目编号：31200741)

北京市科技新星计划(项目编号：Z14144000180000)中国博士后科学基金特别资助项目(项目编号：2014T70959)

杜婷婷 解放军总医院口腔科 硕士生 北京 100853

刘 娜 解放军总医院口腔科 主治医师 北京 100853

张 彤 通讯作者 解放军总医院口腔正畸科 副主任医师副教授 北京 100853