自噬与骨肉瘤相关性研究进展

师德尧 浦飞飞 邵增务

自噬与骨肉瘤相关性研究进展

师德尧 浦飞飞 邵增务

自噬；骨肉瘤；综述

骨肉瘤是一种最为常见的恶性骨肿瘤，起源于原始间充质细胞，特点是恶性肿瘤细胞直接形成骨样组织，也称成骨肉瘤。本病好发于儿童和青少年，以 10～25 岁发病者居多[1]，早期症状主要表现为肢体局部短期疼痛和肿胀。骨肉瘤可发生于人体骨组织任何部位，长骨干骺端为骨肉瘤最易发生的部位，以股骨远端和胫骨近端居多，膝关节约占所有发病部位的 50%[2-3]。骨肉瘤生长迅速，易早期转移，易复发，易对化疗药物产生耐药，目前主要采取手术结合放化疗的综合治疗方案。对于未发生远处转移的骨肉瘤患者，经过规范治疗 5 年生存率可达到 55%～70%，约 90% 的患者可以保肢[4]。相关文献报道，近 85%的骨肉瘤患者初治时已发生远处转移，其中肺转移占绝大部分，对于已发生远处转移的骨肉瘤患者，即使在大剂量辅助化疗的基础上行转移瘤切除术，其 5 年生存率仅为5%～20%[5-7]，且大剂量应用辅助化疗还伴随着严重的药物副作用。因此全方面探究骨肉瘤发病机制并寻找影响骨肉瘤细胞死亡的关键因素是提高骨肉瘤治疗效果的首要任务之一。

自噬是真核生物细胞具备的一种高度保守的自稳机制，在维持细胞代谢需求和某些细胞器的更新方面发挥重要作用，通常自噬被认为是保持细胞生存、进行细胞更新以及维持细胞稳态的重要机制[8]。近来研究认为自噬与诸多疾病相关，如肿瘤，神经退行性疾病，肌病，感染等[9]，目前自噬在恶性肿瘤中的效应逐渐成为研究热点，大量研究提示自噬功能紊乱与肿瘤的发生发展具有密切关系[10-11]。然而，自噬在骨肉瘤发病过程中所发挥的作用，及其机制尚不明确。笔者现就自噬与骨肉瘤相关研究进展报告如下。

一、自噬概述

自噬 ( auotophagy ) 是细胞将胞内受损、变性、衰老或失去功能的蛋白质及细胞器运输到溶酶体，并进行自我消化和降解的过程。自噬以胞浆内出现双层膜结构的自噬体为主要特征[12]。自噬降解产生的氨基酸和其它一些小分子物质可被细胞重新利用或产生能量。“自噬”最早由Ashford 和 Porten 在 1962 年经电子显微镜在人肝细胞中观察到[13]。随着学界对自噬的不断研究，现已证实自噬广泛存在于真核细胞的各种生理和病理生理过程中。广义上的细胞自噬包括三类：巨自噬 ( macroautophagy )，微自噬( microautophagy ) 和分子伴侣介导的自噬 ( chapeonmediated autophagy，CMA )[14]。通常细胞自噬指的是巨自噬。至今研究已发现超过 30 个基因参与自噬调节，这些基因在真核生物间具有高度保守性，统一命名为 Atg( autophagy related gene )[15]。

真核细胞内自噬的过程主要分为以下步骤：自噬的诱导、自噬小泡成核和延伸、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体、自噬溶酶体进一步降解[16]。自噬的生理作用具有两面性。一方面，营养匮乏、缺氧状态、辐射、生长因子缺乏等因素可导致细胞出现代谢性应激，自噬可增加能量和营养物质的储备和供应，细胞得以应对代谢应激；细胞自噬及时清除胞内受损、变性、衰老和失去功能的蛋白质、细胞器及其它大分子，同时也去除胞内病原体，对维持细胞稳态有重要意义；自噬作用可以抑制胞内活性氧簇 ( ROS ) 的产生，减少细胞遗传物质损伤。因此自噬被认为是保证细胞生存、进行细胞更新以及维持细胞稳态的一种重要机制[8,17]。另一方面，有研究发现在即将死亡的细胞中胞浆内出现大量自噬体[18]，因此也有学者认为自噬是一种程序性细胞死亡形式，即 II 型程序性死亡[19]，I 型程序性死亡则指细胞凋亡。

自噬过程的调节机制较为复杂，目前研究主要集中在 PI3K / AKT / mTOR 信号通路。哺乳动物雷帕霉素的靶点，mTOR ( mammalian target of rapamycin )，一种进化保守的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶，是氨基酸、ATP 和激素的感受器，对细胞生长具有重要调节作用。在细胞营养供给正常的情况下，PI3K / AKT / mTOR 信号通路处于活化状态，此时自噬被抑制。反之当细胞出现营养匮乏或处于代谢性应激的情况下，mTOR 受抑制，Atg1 活化，自噬下游信号激活[20]。另一自噬研究热点为 Beclin1 蛋白，研究发现 Beclin1 蛋白参与自噬的调节和肿瘤生成等过程。早期研究认为 Beclin1 是一种与细胞凋亡调节因子 Bcl-2 相互作用的蛋白，后续研究发现在自发性乳腺癌和卵巢癌细胞中，Beclin1 呈单等位基因缺失状态，提示 Beclin1 可能是一种重要的抑癌蛋白[21]。在细胞自噬过程中 Beclin1 是最为重要的正调节因子，Beclin1 通过与 Vps34 / class III PI3K 形成蛋白复合体来发挥激活细胞自噬的功能[22]。

自噬与诸多疾病相关，如肿瘤，神经退行性疾病，肌病，感染等。首次报道称自噬调节蛋白 Beclin1 在人类乳腺癌中表达水平明显降低[23]。近来研究表明，细胞自噬既能通过多种机制抑制恶性肿瘤发生发展，然而又能协助肿瘤细胞逃避凋亡以及适应各种不利环境如放疗辐射，化疗药物等[10,16,24]。诸多文献报道了细胞自噬在多种恶性肿瘤发生、发展及转归过程中发挥“双刃剑”的作用[10,12,18,21]。然而，自噬在骨肉瘤的各种生物学行为中具体发挥怎样的效应，目前还没有明确答案。

二、自噬在骨肉瘤治疗中的两面性及应用前景

通过应用“术前新辅助化疗＋肿瘤手术切除＋术后辅助化疗”这一公认的治疗模式，目前骨肉瘤患者的 5 年生存率和保肢率都得到了明显改善，然而该治疗模式仍有局限性，如部分骨肉瘤患者对一线化疗药物不敏感，骨肉瘤切除与重建方式缺乏统一标准，骨肉瘤术后复发和肺转移治疗效果有限等[25]。因此，探索骨肉瘤治疗的其它可能方法具有重要意义，除了目前仍在探索中的基因治疗，免疫治疗，干细胞治疗等方法外，调控细胞自噬也具备在骨肉瘤治疗中的应用前景。

对于骨肉瘤，许多化疗药物能诱导自噬作用增强，但却产生不同的效应，有的增加肿瘤对化疗药物的敏感性，有的则使得肿瘤耐药性增强。目前学界对于化疗药物诱导的自噬究竟是肿瘤细胞的一种自卫行为还是能够诱导肿瘤细胞死亡尚无定论，但近来越来越多的研究发现在抗肿瘤药物的作用下，通过抑制自噬可以增强肿瘤细胞凋亡。多项研究发现，一些天然药物如姜黄素 ( curcumin )，Pancratistatin 以及老刺木胺 ( voacamine，VOA ) 能够增加骨肉瘤细胞对化疗药物细胞毒作用的敏感性[26-30]。通过电子显微镜观察细胞形态学变化及对自噬标记蛋白 LC3-II的检测，研究者发现 VOA 可诱导多耐药 U2OS 自噬作用增强。此外，联用 VOA 和多柔比星，U2OS 细胞死亡率增加。然而用自噬抑制剂预处理或向骨肉瘤细胞转染抑制 Atg 基因的 siRNA 时，肿瘤细胞死亡率减小[31]。研究发现，对于多个骨肉瘤细胞系，将溶瘤腺病毒 Delta-24-RGD 与多柔比星，顺铂或甲氨蝶呤联用时可产生基于自噬性细胞死亡的协同性细胞毒作用[32]。吖啶黄素( acriflavine ) 是一种防腐剂和抗菌剂，研究发现其通过增强自噬抑制肿瘤生长。研究者观察到吖啶黄素呈剂量相关性地抑制 MG63 细胞增殖。在实验过程中，吖啶黄素通过Beclin1 / Atg5 途径增强自噬，抑制肿瘤生长[33]。另有研究者发现雷公藤通过激活 JNK 和促 ROS 生成诱导细胞凋亡和自噬作用，达到抑瘤作用，且在实验过程中额外给予凋亡抑制剂可增强自噬作用[34]。

然而，近来更多的研究者则认为化疗药物诱导的细胞自噬是一种保护性机制，具有抗凋亡，增强肿瘤细胞生存率和侵袭能力的作用[35]。作为骨肉瘤化疗一线用药的多柔比星，顺铂和甲氨蝶呤，在多项实验研究中被发现具有诱导细胞产生保护性自噬的作用，通过该作用，骨肉瘤细胞生存能力和耐药性均提高[36-38]。Wu 等[39]发现，普通MG63 细胞和耐顺铂细胞系 MG63 / DDP 同时接受顺铂处理，MG63 / DDP 自噬作用较强，当给予 Beclin1 抑制剂处理后，后者自噬小体生成明显减少，对顺铂敏感性显著升高。在 MG63 细胞中，转染 miR101 可通过抑制细胞自噬增强肿瘤细胞凋亡[40]。硝基苯并二唑衍生物 ( nitrobenzoxadiazoles，NBDs ) 是近来受关注的抗肿瘤药物，具有激活 c-Jun 氨基端激酶等作用，体内外已证实其广谱抗肿瘤作用，Palumbo 等[41]发现在 U2OS 中，MC3181，一种NBD 类药物，通过激活 TRAF2 / JNK 信号通路，抑制自噬终末阶段发挥抗肿瘤效应。Lee 等[42]发现，抗肿瘤药物 Dendropanoxide 主要通过诱导细胞凋亡发挥作用，在MG63 细胞中，Dendropanoxide 可激活 ERK1 / 2 诱导肿瘤细胞产生保护性自噬，减若细胞凋亡，联用自噬抑制剂可显著增强 Dendropanoxide 的抗肿瘤效应。紫杉醇在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，通过缺氧诱导因子-1α ( HIF -1α )产生保护性自噬[43]。沙利霉素 ( Salinomycin ) 同时增强U2OS 肿瘤细胞自噬和凋亡效应，给予自噬抑制剂，肿瘤凋亡率明显增加，提示该药物诱导了保护性自噬[44]。

与其它肿瘤一样，细胞自噬在骨肉瘤细胞中发挥着两面性作用，一方面可发挥细胞保护性作用，增强肿瘤细胞的生存能力及耐药性，另一方面，自噬也可作为一种引发肿瘤细胞死亡的机制[45]。因此，为了增强各种药物的抗肿瘤效应，对细胞自噬信号通路以及分子机制的进一步研究尤为重要。通过对相关分子机制的深入研究，调控细胞自噬水平或许能成为骨肉瘤治疗中的有效辅助方法，但该崭新的治疗方法尚处于探索阶段，相关实验尚处于体外细胞研究水平的结果离临床治疗还有距离，需要研究者们投入更多的努力来填补这一领域的空缺。

三、自噬信号通路在骨肉瘤中的研究进展

在近年来针对自噬与骨肉瘤相关性的研究中，自噬调节蛋白 Beclin1 和 PI3K / AKT / mTOR 信号通路是最为主要的研究热点[20,45-46]。研究者们通过对上述两条通路的实验探索，发现了诸多与骨肉瘤发生、发展、侵袭、转移、凋亡抵抗等肿瘤生物学行为相关的细胞自噬分子机制。

1. Beclin1 及其相关上下游调节分子：研究发现，Beclin1 相关自噬关键调节因子 Barkor ( Atg14 ) 在人骨肉瘤细胞 U2OS 中对自噬的诱导起到关键作用。当 U2OS 细胞处于营养匮乏的条件下时，给予 Barkor 蛋白基因抑制处理的细胞内 LC3 II 和自噬体形成明显减少，自噬作用显著减弱，当这类细胞中 Barkor 过表达时，自噬作用增强。在实验中，研究者发现 Barkor 通过直接与 Beclin1 作用，并与 UVRAG 竞争结合位点，发挥增强自噬的作用[47]。在 SaOS2 细胞中给予 Barkor / ATG14 基因抑制，可明显抑制细胞自噬[48]。在 MG63 细胞中，下调 miR-30a 可通过激活 Beclin1 通路增强自噬作用[49]。研究发现，以抗肿瘤药物 2-甲氧基雌二醇处理的骨肉瘤细胞 SaOS2，损伤调控的自噬调节因子 ( DRAM ) 表达上调，c-Jun 氨基末端激酶 ( JNK ) 活化，诱导 Bcl-2 磷酸化和 Beclin1 / Vps34 复合体活化，增强自噬作用[50]。国内研究者发现雷公藤经ROS / JNK 信号通路诱导 MG63 和 U2OS 细胞凋亡和自噬[34]。ATG4B 作为一种半胱氨酸蛋白酶，主要作用是激活 LC3B 的脂化过程以及影响脂化 LC3B 向未脂化 LC3B转化的过程，LC3B 影响自噬小泡的体积和沿微管运输的过程，既往研究认为 ATG4B 在营养匮乏诱导的自噬过程中起关键作用。Akin 等[51]发现应用 ATG4B 拮抗剂( NSC185058 ) 后，SaOS2 细胞自噬作用减弱，且体内体外实验均表现为肿瘤生长抑制，提示 ATG4B 作为自噬抑制靶点，通过抑制肿瘤自噬达到抑瘤作用。低氧状态，是各种实体瘤细胞常见的共有特征，Pursiheimo 等[52]发现，在低氧状态下，肿瘤细胞自噬作用增强，其机制是自噬调节蛋白 p62 降解增加，且该过程不伴缺氧诱导分子 ( HIF )的干预。研究发现视网膜母细胞瘤 ( Rb ) 基因在 SaOS2 中具有激发细胞自噬的作用，其过程主要是 Rb 基因抑制 E2转录因子-1 ( E2F1 )，后者活性减弱使得 Bcl-2 表达下调，促使 Beclin1 / Vsp 复合物活化，增强自噬作用[53]。研究者在向 SaOS2 细胞中转染 Rb 基因后，发现 Beclin1 表达明显增加，自噬作用增强，全过程中并未发现 mTOR 磷酸化作用的增强或减弱，提示 Rb 基因诱导的自噬增强主要是通过调节 E2F1 介导的 Bcl-2 表达，而非经由 mTOR 通路。另有研究发现，细胞坏死中介分子受体相互作用蛋白 -3( RIP3 ) 具有激活自噬的作用，该机制在人骨肉瘤细胞 U2OS中起到肿瘤细胞保护性作用[54]。高迁移率蛋白族 1 ( high mobility group box 1，HMGB1 ) 是一种非组蛋白染色体结合蛋白，它的功能涉及基因转录、基因重组、DNA 损伤修复等多种生物学过程[55]。HMGB1 的过表达是某些肿瘤的特征之一，它与肿瘤在增殖、血管生成和对抗程序性死亡等方面的能力相关。研究发现，HMGB1 具有通过调控Beclin1 / Vsp 复合体来诱导自噬的作用，并以此减弱骨肉瘤对化疗药物的敏感性。实验人员分别向 MG63，SaOS 和U2OS 三种人骨肉瘤细胞中转染 HMGB1 cDNA，均观察到肿瘤细胞对化疗药物的敏感性降低[56]。Guo 等[57]发现在经化疗药物处理的 MG63 细胞中，miR-22 通过与高迁移率族蛋白 1 ( HMGB1 ) 3’ 非翻译区配对下调 HMGB1 表达并抑制 HMGB1 介导的自噬。另有研究发现高迁移率族核小体结合域 5 ( HMGN5 ) 则可通过上调自噬，抑制肿瘤细胞凋亡，增加 U2OS 和 MG63 的耐药性。其机制可能是由于HMGN5 增加了 LC 蛋白小孔形成并增加的自噬小体生成数量[58]。近来又有研究发现一些新的骨肉瘤细胞自噬调节机制。研究发现在 U2OS 中，信号转导和转录激活因子 3( signal transducer and activator of transcription 3，SATA3 ) 能够抑制蛋白激酶 R ( PKR ) 的活性，使真核细胞起始因子 2α( eIF2α ) 的磷酸化过程受限，进而导致自噬的诱导过程受限[59]。巨噬细胞迁移抑制因子 ( MIF ) 是一种炎性相关细胞因子，既往研究提示 MIF 与肿瘤耐药有关，给予 MIF 抑制可产生经由 ROS 诱导的自噬作用增强[60]。

2. PI3K / Akt / mTOR 信号通路：近年来在骨肉瘤的实验研究中，针对自噬相关的 PI3K / Akt / mTOR 信号通路的研究相对少于前者。Takatsune 等发现，SaOS2 和 U2OS在化疗药物作用下，胰岛素样生长因子 IGF-2 通过 PI3K /AKT / mTOR 途径增强细胞自噬达到肿瘤细胞保护作用，是其耐药性的关键因子[61]。此外，PERK 作为一种泛表达的内质网蛋白激酶，通过磷酸化 eIF2α 亚单位在肿瘤生长方面起到重要作用，在 MG63 细胞中，PERK 高度表达，实验发现 PERK 通过 mTOR 途径启动自噬抵抗肿瘤细胞内质网应激介导的凋亡[62]。PRCKI，蛋白激酶 C 的一种变种，在细胞增生，分化和癌变等方面具有重要作用，最近研究将其基因归类为致癌基因。在 U2OS 细胞中，过表达的 PRKCI 损害了细胞正常的功能性自噬，表现为LC3B-II 大量减少和自噬体降解减弱等。进一步实验显示 PRCKI 通过 PI3K / AKT / mTOR 信号通路抑制细胞自噬[63]。另有实验发现化疗药物吉西他滨可通过减弱 Akt 和mTOR 的磷酸化过程以及激活 Beclin1 / Vps34 复合物来诱发自噬过程。

综上所述，目前学术界就自噬与骨肉瘤的相关性及相互作用机制进行了较为广泛的研究及讨论，相关研究已取得了显著的成果，越来越多的研究提示细胞自噬的平衡状态是维持细胞稳态的重要因素，任何打破细胞自噬平衡的因素都有可能促进骨肉瘤的增生能力及耐药性，例如化疗药物诱导的保护性自噬。然而自噬如何具体影响骨肉瘤的发生、发展和远处转移，仍需要大量的研究。目前，临床上对骨肉瘤的治疗效果尚不理想，尤其是早期远处转移者。通过调节骨肉瘤细胞的自噬作用影响其对化疗药物的耐药性可能是未来治疗骨肉瘤的新方向，此外，进一步认知自噬的功能及其各个阶段的分子机制并最终将其应用于临床实践也是当前崭新的研究前景，对骨肉瘤乃至整个肿瘤学都具有重大意义。

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Progress of relationship between autophagy and osteosarcoma

S HI De-yao, PU Fei-fei, SHAO Zeng-wu.Department of Orthopedics, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan, Hubei, 430022, China

Autophagy is an ubiquitously self-stabilizing process in eukaryotes with functions in maintenance of cellular metabolism and renewal of some organelles. The role of autophagy in cancer is indicated as bi-directional in recent researches. Osteosarcoma is a kind of malignant tumor of high mortality. At present, comprehensive therapy for osteosarcoma is effective to a certain extent. But no prominent progresses have been made in recent years. This review summarizes relations between autophagy and its research progress in osteosarcoma in recent years, expecting to prompt some new clues for osteosarcoma treatment.

Autophagy; Osteosarcoma; Review

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.11.012

R738.1

430022 武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科医院

邵增务，Email: szwjj@medmail.com.cn

Correponding author: SHAO Zeng-wu, Email: szwjj@medmail.com.cn

2017-02-27 )

( 本文编辑：裴艳宏 )