骨髓间充质干细胞治疗感音神经性耳聋相关实验技术体系建设概要

彭韬高水超周媛卿洁徐娟朱纲华杨仕明谢鼎华

1中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉头颈外科 中南大学耳科研究所（长沙410011）2解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科 解放军耳鼻咽喉研究所(北京100853)

·综 述·

骨髓间充质干细胞治疗感音神经性耳聋相关实验技术体系建设概要

彭韬1高水超1周媛1卿洁1徐娟1朱纲华1杨仕明2谢鼎华1

1中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉头颈外科 中南大学耳科研究所（长沙410011）2解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科 解放军耳鼻咽喉研究所(北京100853)

感音神经性耳聋是由于内耳感觉细胞的损伤造成的，其治疗一直是耳科医生十分棘手的问题。近年来，利用干细胞修复内耳感觉细胞在国内外大量的研究中取得了诸多重要进展，特别是骨髓间充质干细胞，有易分离、低免疫源性、无致瘤性等优点，极具临床应用价值。但目前国内外各个研究小组从干细胞的制备，诱导到移植内耳的方法均有差异，未形成统一的流程，不利于其学术交流和实验结果大样本收集。本文集中介绍谢鼎华课题组在国家973项目干细胞治疗耳聋的实验技术体系标准制定课题的基础研究方法，并综述目前本领域国际最新动态，初步提出骨髓间充质干细胞治疗感音神经性耳聋的技术方法和质量控制措施的推荐方案，为最终临床安全、规范化运用干细胞治疗耳聋提供依据。

骨髓间充质干细胞；耳聋；实验技术体系

This work was supported by grants from National Basic Research Program of China(973,grant number:2012CB967904, 2012CB967900)and Independent innovation projectof Centralsouth university(grantnumber:2016zzts139)

Theauthors reportno competing financial interests.

耳聋是全球常见疾病，被认为是发达国家最普遍的残疾。2012年，WHO估算全球有3.6亿人有残疾性听力损伤，其中3200万是儿童（http:// www.who.int/pbd/deafness/estimates/en/）。在当前信息社会中，正常的听觉是人们生活、学习和社会交往必不可少的。听觉功能主要依赖毛细胞的感受和与之相连的螺旋神经元（spiral ganglion neuron, SGN）的传导，这两种内耳细胞的损伤导致永久性的感音神 经性聋（Sensorineural hearing loss, SNHL）。目前治疗SNHL的方法有人工耳蜗植入和听觉脑干植入，但都未能恢复正常听觉结构，治疗有一定局限性[1]。因此，国内外的研究者开始将目光转向干细胞的研究，希望通过干细胞来再生或修复内耳感觉细胞，从根本上治疗SNHL。间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cell,MSC）是一类中胚层来源的成体干细胞，存在于骨髓及许多成体器官结缔组织中。骨髓是MSC主要来源，而且取材方便，所以关于骨髓间充质干细胞（bonemar⁃row mesenchymal stem cell,BMSC）的研究最多，是目前能临床应用的为数不多的一种干细胞[2]。

先前有报道利用外源蛋白激活部分信号通路或者与内耳细胞共培养都能将BMSC转化为毛细胞样细胞和神经元样细胞[3-5]，BMSC在体外诱导或者直接移植入耳蜗治疗感音神经性耳聋动物模型后[6-8]，获得了一定的效果，但各个研究小组从干细胞的制备，诱导到移植内耳的方法均有差异，未形成统一的流程，不利于其学术交流和实验结果大样本收集。本文目的在于建立一个BMSC在感音神经性耳聋治疗相关实验技术的相对成熟体系，主要对供体质量标准，干细胞的制备与鉴定，诱导分化，冻存复苏，动物模型，移植途径，细胞浓度，安全性和有效性这八个关键实验技术问题进行重点探索和研发。

1 供体质量标准

先天性及语前感音神经性耳聋主要由遗传因素（约50%）引起，其次为耳毒性药物及孕期内耳及神经发育干扰因素等。因此对于供体质量标准的建立，干细胞供体致聋基因检测成为重要组成部分，其次还应常规检测干细胞供体有无急慢性传染病，必要时检测供体HLA类型。

遗传性耳聋具有高度遗传异质性，目前多达70余种听觉相关基因已被确定与非综合征性或综合征性耳聋相关(http://hereditaryhearingloss.org)。常规的基因芯片筛查可采用多重等位基因特异性PCR与通用芯片技术相结合技术(allele-specific PCR-based universal array，ASPUA，博奥生物公司)，但仍有大量考虑遗传性耳聋的患者的遗传致聋基因不明确。

随着高通量序列捕获方法和新一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）的发展，使得全外显子组测序（Whole exome sequencing，WES）在阐述孟德尔遗传疾病新的遗传基础和具有遗传异质性特征疾病的遗传基础具有技术可行性和高效能特征[9]。靶向的或者全外显子组测序被证实是目前寻找非综合征及综合征性耳聋最强有力的方法，特别是在具有显现特定耳聋表达，但因规模过小不能连锁定位的小家系而言尤为有效。

1.1 全外显子组测序

（1）根据制造商标准流程，使用SureSelet人类全外显子组50Mb试剂盒进行溶液杂交选择方法对编码外显子及其侧翼内含子富含区域进行测序。通过绑定Illumina Hiseq2000适配序列，DNA富含样本被高通量的Hiseq2000仪器测序分析。

（2）测序后产生的大量遗传数据通过Bur⁃rows-Wheeler Aligner(BWA),Genome Analysis Tool⁃kit(GATK)，和SeattleSeq等软件及数据库处理分析。

（3）定位读取、变异体检测、数据过滤分析和注解在之前的报道中有所注解[9]。

2 BMSC的制备和鉴定

骨髓中BMSC含量极少，仅占骨髓单核细胞的0.002%-0.005%[10]，因此制定BMSC体外培养技术标准，因从细胞类型、纯度、活性及功能进行评估，而分类鉴定是建立质量标准的基础，目前比较通用的是国际细胞治疗协会（ISCT）对MSC的三条最低鉴定标准[11]：①塑料粘附性，即在培养瓶中细胞贴壁生长；②表达标志为CD14-或CD11b-，CD19-或CD79+，CD34-，CD45-，HLA-DR-，CD73+，CD90+，CD05+；③具有多向分化潜能，即在体外可以诱导分化为成骨细胞、软骨母细胞和脂肪细胞。其中流式细胞仪分析细胞表型是检测重点，不仅应检测分离后细胞表型，还应对细胞传代后表型稳定性进行研究[12]。

2.1 BMSC制备

（1）4周龄SD大鼠处死消毒后，取其双侧股骨和胫骨，用DMEM冲洗骨髓，收集冲洗液。

（2）将骨髓冲洗液缓慢加入密度为1.077g/m l的Ficoll分离液中，离心后用巴氏吸管取出单核细胞层，PBS洗涤细胞2次。

（3）用含10%胎牛血清的低糖DMEM重悬细胞，以1.0×105cell/ml接种于T25培养瓶中，放置于37℃、5%CO2环境细胞培养箱内，每隔两天换培养液。

2.2 BMSC鉴定

2.2.1 流式细胞仪检测

（1）将细胞消化后悬浮细胞，分批次加入抗MSC表面标志物抗体，冰上孵育30分钟后，PBS洗涤3次[4]。

（2）用4%多聚甲醛固定10分钟，PBS洗涤3次后，上流式细胞仪检测。

2.2.2 体外诱导BMSC向成骨成脂分化及茜素红和油红O染色

（1）将细胞消化后悬浮细胞，以0.5×104cell/m l密度接种至培养皿。

（2）3天后培养基改为骨分化试剂盒、脂肪分化试剂盒（美国Gibco公司），每3-4天换液一次，持续培养2周。

（3）分化后细胞用PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定30分钟。

（4）分别用茜素红染色骨分化细胞、油红O染色脂肪分化细胞，PBS漂洗后吸净残余液体，显微镜下观察。

3 BMSC冻存及复苏

干细胞在低于-80℃的超低温条件下，内部的生化反应变慢，而在低于-196℃（液氮）时，生化反应几乎终止。而将冻存的干细胞快速恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复。冷冻保护剂能与溶液中的水分子结合，能降低冰点，减少冰晶的形成；还可以通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受高溶质损伤。在细胞复苏过程中，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，此时干细胞内外不会产生过多冰晶，而且干细胞在高浓度电解质溶液中时间很短。最常用的渗透性冻存保护剂为二甲基亚砜（DMSO），但其不能防止细胞内结冰而且常温下对细胞毒性较大，所以需要一定时间预冷，复苏时也应及时洗涤细胞。传统冻存方式逐步降温操作繁琐，每一步操作对干细胞的复苏率有着极大的影响。本课题组推荐运用无蛋白非程序冻存液对BMSCs进行冻存复苏。该方法将传统冻存方式逐步降温方式优化为一步降温，减少细胞污染机会，同时无任何外源蛋白成分，有利于后续实验开展[13]。

3.1 BMSC冻存

（1）将细胞消化后PBS洗涤2次，沉淀至离心管内。

（2）加入适量CELLBANKER2无血清型细胞冻存液，以5×105-6cell/ml细胞浓度制成细胞悬液。

（3）将细胞悬液分装于注明信息的冻存管中，缠绕封口膜。

（4）直接将冻存管放入-80℃冰箱，隔夜后放置于-196℃液氮中。

3.2 BMSC复苏

（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，立即置于37℃震荡水浴箱中，快速晃动溶解。

（2）待冻存管中细胞悬液溶解后，加入细胞培养基离心洗涤3次。

（3）加入适量的新鲜细胞培养基，以1×105cell/ m l细胞浓度接种至T25培养瓶中，隔天更换培养基。

4 BMSC向螺旋神经元样细胞分化和鉴定

目前BMSC向神经细胞诱导分化主要包括神经营养因子诱导，共培养诱导和转基因诱导等方法[14]。内耳在发育过程中需要产生各种神经营养因子及相关蛋白包括骨形成蛋白-4（BMP4）、音猬因子（SHH）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子-3（NT-3）等，它们不仅能激活信号通路，调控相关基因，诱导关键蛋白合成，使干细胞向感觉神经终末细胞发育，而且对诱导后细胞的维持生长具有重要作用[15]。而间接（非接触）共培养体系模拟了移植进内耳的BMSC被基底膜和螺旋神经元分隔的状态，但允许各种因子从一侧自由扩散到另一侧，细胞之间的物质交流可能促进BMSCs向神经细胞发育。通过对比各种诱导方案，目前认为神经营养因子及共培养诱导方案排斥反应及成瘤性更小，是更适合临床应用的推荐方案[16]。

4.1 BMSC向螺旋神经元样细胞分化

4.1.1 神经营养因子诱导

（1）用多聚赖氨酸（0.1mg/ml）铺被于培养皿上，室温过夜后PBS漂洗3次。

（2）将细胞消化后接种于铺被好的培养皿中。

（3）2天后更换培养基为内耳神经前体细胞诱导液（包含音猬因子及全反式维甲酸）[4]，2-3天换液一次。

（4）持续培养6天后培养基换为感觉神经元细胞诱导液（含BMP4），2-3天换液一次，持续培养6天后鉴定检测。

4.1.2 耳蜗基底膜共培养诱导

（1）将鼠尾胶原蛋白溶液与10×Eagle培养基、2%碳酸钠以9:1:1的比例预先充分混合，取15微升的混合液放置于培养皿中心，放置10分钟，然后加入1m l基底膜混合培养溶液（1%无血清BME，1% FBS，2mM谷氨酰胺，5mg／ml葡萄糖，10U／m l青霉素）。

（2）将出生3天的SD大鼠酒精消毒后迅速断头，听泡放置于PBS溶液中，将基底膜组织解剖出来：用游丝镊去除听泡外层的骨壳，再小心剥除耳蜗外层的蜗壳，显露出其内部的膜迷路结构，继续去除耳蜗的螺旋韧带和血管纹组织，从底转开始沿蜗轴与基底膜相连接出断开，自底转向顶转仔细分离，直至基底膜与蜗轴完全分开。将耳蜗基底膜组织转移到粘附于培养皿底、浸泡于无血清培养基的鼠尾胶滴上，注意分辨清楚基底膜的前庭膜面朝上，将培养皿放置于细胞培养箱中，12小时后换为含有5%FBS的培养基。

（3）传代第三代的BMSC，以1.0×105的密度接种于下层培养皿中，培养24小时细胞贴壁。将鼠尾胶滴连同其上培养的耳蜗基底膜组织一起取下，置于Transwell培养室的上层培养皿中，行间接共培养每48小时换一次液，共培养2周。

4.2 诱导后细胞鉴定

由于SGNs缺乏特异性的分子标志物，目前无法通过单一的表面蛋白准确鉴定SGNs，目前国际上比较推荐检测神经元相关蛋白及基因包括Tuj1、MAP2、Neurog1、NeuroD、NF-M等[4,14,15]。SGNs既接受毛细胞释放的兴奋性神经递质（谷氨酸）对它的兴奋作用，同时也接受来自于传出神经系统橄榄耳蜗束传出神经的传出末梢释放的抑制性神经递质（γ-氨基丁酸，GABA）对它的抑制性调节，通过检测诱导后细胞谷氨酸受体（GluR2/3）和GABA受体（GABARAP）也可以分析神经递质类型。此外通过膜片钳技术检测细胞的动作电位，电压依赖性钠、钾、钙通道及FM1-43吞吐功能（突触功能），可以在功能上进一步鉴定。综上，本研究小组推荐从细胞双极形态、蛋白表达水平、神经递质类型、电生理检测上多方面鉴定诱导后细胞。

4.2.1 神经递质类型及螺旋神经节相关蛋白免疫荧光检测

（1）细胞玻片用4%的多聚甲醛固定30分钟，PBS溶液漂洗3次。

（2）0.25%Triton X-100破膜30分钟，PBS溶液漂洗3次。

（3）吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加10%正常山羊血清和1%牛血清白蛋白，室温封闭30分钟。

（4）吸水纸轻柔吸掉封闭液，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。一抗：兔抗-Tuj1(β-tubulinⅢ,abcam,1:500),鼠抗-MAP2(Sigma,1:500),兔抗-GluR2/3(Abgent,1: 500)，兔抗-GABARAP(Sigma,1:300)。

（5）加荧光二抗：PBS溶液洗3次后吸干标本上液体，滴加相应荧光二抗，37℃湿盒中孵育1小时。

（6）染核：滴加DAPI避光孵育5分钟，PBS溶液洗3次，每次5分钟。

（7）吸净标本上液体，封片胶封闭标本，激光共聚焦扫描显微镜（Zeiss LSM 780）采集图像。

4.2.2 RT-PCR

为了研究诱导后细胞表达的基因是否与SGNs相同，采用RT-PCR(reverse transcription-PCR)来检测SGNs相关基因（NeuroD,Neurog1,NF-M）在诱导后细胞的表达情况。

分别取诱导后细胞、SGNs、BMSC-GFP三种细胞，加入Trizol(Invitrogen)提取总RNA，用紫外分光光度计测定A260/A280值，判断RNA纯度和质量。取RNA吸光度在1.9-2.0之间的样本进行cD⁃NA的合成。使用SuperscriptⅢ(Invitrogen)按试剂盒说明进行cDNA的合成。

4.2.3 电生理检测

两步法拉制玻璃微电极，电极尖端直径0.5-1µm，充灌电极内液后电阻为1-3MΩ。将培养有诱导后细胞的玻片置于浴槽中，选择折光性好，边缘光滑、细胞体较大的细胞进行记录。用细胞外液以1ml/min恒速灌流，调节微操纵仪，使电极尖端与细胞膜接触，形成高阻封接（>1MΩ）后采用真空抽吸的方法破膜。在电压钳模式下，记录Na+电流和K+电流；电流钳模式下，记录动作电位。浴液成分为（mM）：120 NaCl,30 glucose,25 HEPES,5 KCl, 2 CaCl2,1MgCl2,用NaOH调PH值为7.3，渗透压为297mOsm。电极内液成分为(mM)：147 KCl,5 Na-phosphocreatine,2 EGTA,10 HEPES,4 MgATP, and 0.5 Na2GTP,用KOH调PH值为7.3，渗透压为300mOsm。

5 耳聋模型

乌本苷（Ouabain）是一种常见的强心苷，可以选择性与Na+-K+-ATP酶相结合，并抑制其活性。在沙鼠的圆窗膜处置入乌本苷溶液，可引起螺旋神经元的大量凋亡，同时毛细胞的形态和功能均未受到明显的影响[17]。这种听神经病动物模型可用于细胞移植相关治疗的实验研究，从而引起很多研究者的极大兴趣，是目前比较成熟且确切的神经性耳聋的造模药物，可通过耳蜗切片及听力检测来检测造模效果。

5.1 乌本苷圆窗给药手术

（1）动物麻醉后俯卧位，清理术区消毒后，沿耳廓后缘做长约1cm的切口。在手术显微镜下用解剖镊分离皮下和肌肉组织，暴露听泡外的蜂窝样骨质，用电钻打开听泡，显露圆窗和圆窗膜。

（2）用微量注射器取10微升的Ouabain溶液10mM，显微镜下小心的置于圆窗膜上，保持动物体位固定不动15分钟后缝合关闭伤口。

（3）手术后将动物置于保温垫上，保持体温醒麻醉，肌肉注射青霉素80单位;手术后两小时行ABR测听。

5.2 耳蜗取材及HE染色

（1）用足量戊巴比妥钠溶液将动物麻醉后，断头处死。完整的取出听泡，解剖分离出耳蜗，自蜗尖开窗，打开圆窗膜，对耳蜗进行4%多聚甲醛灌洗固定，置于4℃冰箱中固定24小时。

（2）固定后的耳蜗进行石蜡包埋和切片，行免疫组化染色观察：沿下列顺序进行，酒精浓度70%（过夜）—80%（2小时）—90%（2小时）—95%（2小时）—100%（2小时）—二甲苯（2小时）。

（3）将耳蜗组织置于液态石蜡中浸蜡1小时。将浸好蜡的组织倒入石蜡将组织块包埋。待石蜡冷却成固态即包埋完毕。进行石蜡组织块切片，并进行HE染色。

6 BMSC内耳移植途径和细胞浓度

BMSC的内耳移植途径主要包括经鼓阶的外淋巴系统移植、经中阶的内淋巴系统移植、蜗轴和听神经干径路移植。鼓阶途径是将干细胞植入外淋巴，移植空间大，流动的外淋巴液有利于移植细胞的迁移及分布，并且鼓阶处的开窗对神经的损伤小，术后听力影响不大。因此，多数干细胞内耳移植的研究，都采用了鼓阶外淋巴系统移植。有学者比较了豚鼠空白对照组、单纯耳蜗造孔组及BMSC经耳蜗造孔移植组的术后听力改变，证实了鼓阶开窗行BMSC移植手术对动物的听力及耳蜗形态学影响是轻微的，移植后干细胞能在耳蜗内迁移、存活[18]。Kamiya等在急性听力损失的鼠模型中，经外半规管植入干细胞，发现干细胞能在某些趋化因子的作用下迁徙到耳蜗外侧壁损伤部位，并且损伤部位的细胞数明显高于非损伤部位[19]。

对于建立较规范的间充质干细胞内耳移植的标准而言，除了要明确不同的移植途径对移植细胞分布的影响，还要选择一个合适的移植数目。目前国内外对移植细胞数目并未达成共识，多集中在104~107个/ml。细胞植入后既要产生一定预期的生物学功能，又不能对听力造成过多的损失。本研究小组对不同浓度干细胞移植经行综合分析，发现105个/m l细胞浓度的植入对听力损伤最小，而且2周后存活细胞较多。

6.1 鼓阶途径内耳移植

（1）动物麻醉后俯卧位，清理术区消毒后，沿耳廓后缘做长约1cm的切口。在手术显微镜下用解剖镊分离皮下和肌肉组织，暴露听泡外的蜂窝样骨质，用电钻打开听泡，显露镫骨肌动脉、圆窗龛及耳蜗底转靠近镫骨肌动脉的部分;

（2）用微钻在鼓阶外侧壁造孔，引流部分外淋巴液;

（3）用微量注射器取105个/m l细胞悬液10ul，显微镜下缓慢注入鼓阶。

（4）骨蜡封闭鼓阶后，缝合术腔。

7 BMSC内耳移植安全性

建立BMSC内耳移植的安全性质量规范包括毒理试验，外源因子检测以及干细胞移植后动物耳蜗长期观察。毒理实验依据《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》，对体外诱导分化后的干细胞进行急性毒性试验。外源因子检测规范，按2000版《中国生物制品规程》，运用相关检测试剂盒对体外诱导分化的干细胞进行无菌检测、支原体检测、病毒因子检测、细菌内毒素检测、外源细胞因子检测分析。

有关耳蜗的形态学研究目前主要依靠通过耳蜗组织的冰冻切片或者石蜡切片和基底膜铺片后，用显微镜进行观察，但切片的过程破坏了标本的原始性，易生成伪像。本研究小组推荐应用Micro-CT对移植后动物耳蜗进行安全性检测，优势在于能对动物进行长时间活体连续观察。Micro-CT拥有超高清的分辨率，并引进了圆锥形光束运算法则，提高了非侵入性的小动物成像研究专用扫描仪器的实用性。另外，引进了提升软组织对比度的新型增强剂之后，Micro-CT已经可以应用于临床前研究的体内试验，来研究观察软组织结构和血管形态。该技术已可应用到耳科学的基础研究和药物实验中，可观察耳部的鼓膜、听骨链、耳蜗、半规管等精细结构[20]。

8 BMSC内耳移植有效性

目前内耳移植有效性的研究主要聚焦在两个层面，一是干细胞移植后能否到达SGN聚集区域包括基底膜、罗氏管和蜗轴区域，并且能与毛细胞发生联系，需要通过耳蜗切片荧光染色来确定；二是听力功能恢复的直接证据，通过听性脑干反应（ABR）和耳声发射（DPOAE）来检测。

8.1 耳蜗切片免疫荧光染色

（1）耳蜗冰冻切片用5%的山羊血清浸泡封闭1小时后，PBS溶液漂洗。

（2）加入鼠来源一抗β-Tubulin III（1：200），4℃环境中孵育12小时后PBS溶液漂洗3次。

（3）加入相应荧光二抗避光环境中，常温下孵育1小时后PBS溶液漂洗3次。

（4）吸净标本上液体，封片胶封闭标本，激光共聚焦扫描显微镜采集图像。

（5）螺旋神经元计数：取连续耳蜗中轴断面的组织切片，每个耳蜗选取相应的螺旋神经节区域作为螺旋神经元的计数区域（细胞数/mm2）。螺旋神经元用神经元特异性标志物β-Tubulin III抗体进行免疫荧光染色标记，阳性细胞为神经元细胞。为了避免在计数过程中的偏差，我们根据Lang等[21]人的方法使用Abercromie校正因子来减少技术偏差。

8.2 听功能检测

分别于移植前、移植后1周、2周、3周、4周检测动物听功能。听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）阈值测试采用美国TDT系统（Tuck⁃er-Davis Technologies hardware and software,TDT System III）。按如下步骤进行ABR和DPOAE:

（1）动物麻醉后，在隔声屏蔽室将参考电极置于测试耳耳后，记录电极置于颅顶正中，接地电极置于测试耳对侧耳后。

（2）刺激声为短声、短纯音4kHz、8kHz、16kHz、32kHz，设置声刺激持续时间为10ms,带通滤波宽度设置为300-3000HZ，叠加次数为1024次。

（3）最大刺激声强度为l00dB SPL，每隔l0dB SPL递减，以能分辨出可重复的ABR波I的最低刺激强度判断阈值。在每个频率的90dB SPL，测量ABR波I的潜伏期与振幅。

（4）DPOAE探头密封于动物外耳道内，原始纯音频率比f2/f1为1.2，L2/L1=60/65 dB。

9 总结

感音神经性聋特别是神经性耳聋的治疗一直是耳科医生十分棘手的问题，干细胞的出现为其治疗带来了一线新的曙光。经过学者们多年的研究，对于BMSC在感音神经性耳聋治疗方面取得了长足的进展，然而关于干细胞采集、纯化、诱导等制备技术和移植后安全性有效性的评价都未形成一套比较成熟的实验技术流程体系，因此无法真正将BMSC应用于临床治疗。本文是对BMSC治疗感音神经性耳聋的技术方法和质量控制措施建立的一次尝试，为最终临床安全和系统的运用干细胞治疗耳聋提供依据。随着干细胞研究的不断深入，相信不久的将来能在临床上成为治疗感音神经性耳聋的有效手段。

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BoneM arrow M esenchymalStem Cells in The Treatmentof SensorineuralHearing Loss:A Summary of The Related Technical System s

PENGTao1，GAOShuichao1，ZHOUYuan1，QIN Jie1，XU Juan1，ZHUGanghua1，YANGShiming2，XIEDinghua1
1DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,Second Xiangya HospitalofCentralSouth University,Instituteof Otology ofCentral South University,Changsha,410011
2 DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,PLAGeneralHospital,Beijing,100853

XIEDinghua Email:dhuaxie@163.com

Sensorineural hearing loss(SNHL)can be caused by lesions of inner ear sensory cells.Treatment of SNHL remainsa challenge for clinicians.A new treatment for SNHL is the repair and regeneration of inner ear sensory cellsusing stem cells.Numerousadvances currently have been achieved in thisarea.Because of their low immunogenicity and easy accessibility,mesenchymal stromal cells(MSCs)have recently been considered as one of potentially ideal alternatives to restore degenerated inner ear sensory cells.However,research methods vary among research groups, from preparation to transplantation of stem cells,and no standardized process is established yet.This article focuses on the progress by Ding-hua Xie’s group in treating SNHL and describes the latestadvancesworldw ide.The paper aims to establish prelim inary standards for stem cells preparation and quality control for treatmentof SNHL,and to provide theoreticalevidence for clinical treatmentof SNHL using stem cells.

BoneMarrow Mesenchymal Stem Cells;SensorineuralHearing Loss；Technical System

R764

A

1672-2922（2017）03-350-7

2016-11-21审核人：翟所强）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.015

国家重点基础研究发展计划（973）:2012CB967900和2012CB967904；中南大学博士生自主创新项目：2016zzts139

彭韬，博士研究生在读，研究方向:干细胞

谢鼎华，Email:dhuaxie@163.com