沉默EphA2表达对胃癌AGS细胞上皮-间质转化的影响*

侯福涛，黄忠诚，陈子华

（1.湖南省人民医院胃肠结直肠肛门外科，长沙410005；2.中南大学湘雅医院胃肠外科，湖南长沙410008）

沉默EphA2表达对胃癌AGS细胞上皮-间质转化的影响*

侯福涛1，黄忠诚1，陈子华2△

（1.湖南省人民医院胃肠结直肠肛门外科，长沙410005；2.中南大学湘雅医院胃肠外科，湖南长沙410008）

目的探讨EphA2基因表达沉默对胃癌AGS细胞上皮-间质转化的影响机制。方法将对数生长期的胃癌AGS细胞接种于6孔板并分为EphA2 siRNA组、阴性对照组和空白对照组。采用EphA2 siRNA转染胃癌AGS细胞，采用实时定量聚合酶链反应检测转染细胞EphA2的表达，采用相差显微镜观察细胞形态的变化，采用Transwell实验检测转染细胞的侵袭能力，应用蛋白质印迹法检测转染细胞E-cadherin和vimentin蛋白的表达。结果EphA2 siRNA组的EphA2 mRNA相对表达量（0.343±0.035）明显低于阴性对照组（0.950±0.036）和空白对照组（0.997±0.065），差异均有统计学意义（P＜0.05）；EphA2 siRNA组胃癌AGS细胞呈上皮细胞样，阴性对照组和空白对照组细胞呈间质样细胞；EphA2 siRNA组的侵袭细胞数[（29.1±2.6）个]明显少于阴性对照组[（52.2±2.6）个]和空白对照组[（56.2±4.0）个]，差异均有统计学意义（P＜0.05）；EphA2 siRNA组E-cadherin蛋白的表达量较阴性对照组和空白对照的E-cadherin蛋白的表达量明显上调，而vimentin蛋白的表达量明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论沉默AGS细胞EphA2的表达能够抑制胃癌细胞由上皮样细胞向间质样细胞转化，降低AGS细胞的侵袭力，上调上皮性标志物E-cadherin的表达，下调间质性标志物vimentin的表达。

胃肿瘤； RNA； 基因表达； 蛋白质类； 基因沉默； 上皮细胞； 生物转化

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，为恶性肿瘤第2死因[1]。侵袭转移和术后复发是大多数胃癌患者的主要死亡原因。胃癌浸润、转移涉及多个分子、多条信号转导通路的相互作用和交叉调控。上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质样细胞转化的现象[2]。具体表现为细胞间黏附连接表达下调，如E-cadherin/catenins复合体，出现间质细胞标志物如N-cadherin、vimentin等表达，细胞重排、形成新的细胞基质之间的黏附等，对于肿瘤细胞结果就是细胞之间的黏附力减弱，侵袭能力增强，通过EMT为上皮来源的肿瘤细胞提供侵袭转移基础[3]。Eph基因家族具有受体酪氨酸激酶的活性，在调控肿瘤细胞生长、增殖、转移相关的信号转导通路中起关键作用[4]。EphA2受体是目前发现的14种Eph受体之一，在多种上皮性肿瘤中呈高表达[5]。最近有研究发现，EphA2与EMT有关，但其机制尚不十分明确[6]。深入研究EphA2调控胃癌EMT的机制，能为胃癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌AGS细胞购自中科院上海细胞库；选择针对EphA2 mRNA第317～335位序列为RNA干扰的靶序列，由上海吉玛制药技术有限公司合成；EphA2抗体、E-cadherin抗体、vimentin抗体均购自美国Santa Cruz公司；GAPDH抗体购自北京中杉金桥生物公司；Transwell小室购自美国康宁公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；胎牛血清、PRMI1640培养基均购自美国Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及EphA2 siRNA转染 AGS细胞常规培养于PRMI1640培养基（含10%胎牛血清）中，1～2 d更换培养基，2～4 d用0.25%胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。将对数生长期AGS细胞接种于6孔板并分为三组（EphA2 siRNA组、阴性对照组、空白对照组），待细胞生长至80%左右融合时进行转染：EphA2 siRNA转染组加入Lipofectamine2000、无血清双抗培养基（OPTI-MEMI）及siRNA（终浓度为20 mmol/L）；阴性对照组加入 Lipofectamine2000、OPTI-MEMI及control siRNA（终浓度为20mmol/L）。质粒转染按照Lipofectamine2000转染试剂说明书进行。转染后，三组细胞继续培养6 h后更换PRMI-1640培养基（含10%胎牛血清），继续培养24h。

1.2.2 转染后AGS细胞EphA2 mRNA的检测 转染了EphA2 siRNA、control siRNA和未转染的AGS细胞培养24 h后，收集细胞实时定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测EphA2 mRNA的表达情况。用Trizol试剂盒提取各组细胞总RNA。实时定量RT-PCR套装试剂盒进行反转录及PCR。定量PCR反应条件：42℃、90min，95℃、5 min，冰上冷却，扩增40个循环。内参选用β-actin。引物序列：EphA2上游引物为5′-GAGAAGGATGGCGAGTTCAG-3′，下游引物为5′-TCAGACACCTTGCA GACCAG-3′；β-actin上游引物为5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3′，下游引物为5′-ATCCTTCTGACCCATGCCCACCA-3′。每个反应设3个复孔。EphA2 mRNA相对表达采用ΔΔCt法计算。

1.2.3 各组AGS细胞形态观察 采用相差显微镜进行观察。AGS细胞转染EphA2 siRNA（EphA2 siRNA组）、control siRNA（阴性对照组）和未转染细胞（空白对照组）培养48 h消化后制成细胞悬液，以每孔2×104个接种至6孔板。每组分别设3个复孔，相差显微镜观察细胞形态变化并拍照。

1.2.4 各组AGS细胞侵袭能力检测 采用Transwell实验进行检测。Transwell小室底部膜的上室面用50 mg/L基质胶1∶8稀释液包被，4℃风干，然后加入50 μL含10 g/L胎牛血清的清蛋白培养液，于37℃、5%CO2培养箱30 min使基质胶凝固；胰酶消化收集各组细胞后调整细胞密度至每孔1×105个，制成单细胞悬液，取100μL加入小室上层，下层加入500 μL PRMI1640培养基（含10%胎牛血清），培养箱内培养24 h，取出小室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，然后95%乙醇固定15min，甲苯胺蓝染色5 min，计数膜背面的细胞，计算10个视野细胞数的平均值。

1.2.5 各组AGS细胞E-cadherin、vimentin蛋白表达检测 采用蛋白质印迹法（Western blotting）法进行检测。转染siRNA48h后收集各组细胞，加细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白；核酸检测仪测定蛋白质浓度后，各组以每孔40 μg蛋白上样；浓缩胶上电泳电压为60 V，分离胶上电泳电压为100 V，电泳3 h；用硝酸纤维素膜转膜，用5%脱脂牛奶封闭后分别加E-cadherin抗体、vimentin抗体和GAPDH抗体4℃孵育过夜；以Tris-PBS洗膜3次，每次5 min，室温下避光孵育二抗1 h；用Tris-PBS洗膜3次，每次5 min，用Odyssey双色红外荧光扫膜成像。以目的蛋白与内参GAPDH条带灰度值的比值表示蛋白质的相对含量。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组胃癌AGS细胞EphA2 mRNA的相对表达量比较 EphA2 siRNA组的EphA2 mRNA相对表达量（0.343±0.035）明显低于阴性对照组（0.950±0.036）和空白对照组（0.997±0.065），差异均有统计学意义（P＜0.05）。阴性对照组与空白对照组EphA2 mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 三组胃癌AGS细胞EphA2 mRNA的相对表达量比较

2.2 三组胃癌AGS细胞形态变化情况 EphA2 siRNA组胃癌AGS细胞呈上皮细胞样，形态呈圆形、椭圆形、多角形等，阴性对照组和空白对照组细胞转化为梭形，极性丧失，细胞间隙增宽，呈间质样细胞，见图2。

图2 三组胃癌AGS细胞形态变化情况

2.3 三组胃癌AGS细胞侵袭能力比较 EphA2 siRNA组的侵袭细胞数[（29.1±2.6）个]明显少于阴性对照组[（52.2±2.6）个]和空白对照组[（56.2±4.0）个]，差异均有统计学意义（P＜0.05），而阴性对照组和空白对照组的侵袭细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图3 三组胃癌AGS细胞侵袭图

2.4 三组胃癌AGS细胞E-cadherin、vimentin蛋白表达比较 EphA2 siRNA组E-cadherin蛋白的表达量较阴性对照组和空白对照明显上调，差异均有统计学意义（P＜0.05），阴性对照组和空白对照组E-cadherin蛋白的表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；EphA2 siRNA组vimentin蛋白的表达量较阴性对照组和空白对照明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05），而阴性对照组和空白对照组vimentin蛋白的表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4、表1。

图4 Western blotting检测三组胃癌AGS细胞中E-cadherin、vimentin蛋白的表达

表1 各组AGS细胞E-cadherin、vimentin蛋白的相对表达量比较（±s）

表1 各组AGS细胞E-cadherin、vimentin蛋白的相对表达量比较（±s）

注：与EphA2 siRNA组比较，aP＜0.05。

指标 空白对照组 Control siRNA组 EphA2 siRNA组E-cadherin vimentin 0.183±0.009a0.128±0.009a0.179±0.009a0.125±0.008a0.278±0.011 0.063±0.009

3 讨 论

胃癌在胃肠道肿瘤中预后较差，与其容易发生浸润转移相关。肿瘤的转移主要包括侵袭、内渗、外渗和转移4个步骤。远处转移具体表现为肿瘤细胞失去细胞间黏附，获得迁移能力离开原发灶，渗入内皮血管或淋巴管进入体循环，然后外渗定居于远端位点[7]。

近年来国内外研究发现，EMT与肿瘤浸润转移相关，可能与肿瘤细胞的侵袭转移能力及肿瘤干细胞关系密切[8]。1982年Greenburg等[9]首次提出了EMT的概念，主要特征是上皮细胞表型的丧失和间质特性的获得。EMT的主要分子特征为：上皮性标记物如E-cadherin、αcatenin、桥粒蛋白、细胞角蛋白等表达下调，间质性标记物如vimentin、粘连蛋白、N-cadherin、β-catenin、基质金属蛋白酶类等表达上调[10]。

EphA2在上皮来源的肿瘤中高表达。本研究证实，胃癌AGS细胞EphA2呈高表达。有研究表明，EphA2在肿瘤中高表达存在转录和转录后的调节机制[11]。Fang等[12]研究发现，E-cadherin的功能也可以被Eph受体和配体调节，表明EphA2在肿瘤细胞的生物行为可能通过E-cadherin发挥作用，调节肿瘤细胞之间的黏附。本研究应用RNA干扰技术成功抑制了EphA2在AGS细胞中的表达，在EphA2 siRNA的作用下使AGS细胞在细胞形态方面呈现上皮样改变，抑制了AGS细胞由上皮样细胞向间质样细胞的转化，而且转染EphA2 siRNA后AGS细胞的侵袭能力明显下降。在EMT分子特征方面，通过EphA2 siRNA作用后，上调了AGS细胞上皮表型标志物E-cadherin的表达，下调了间质表型标志物vimentin的表达。因此，作者认为，EphA2 siRNA能够抑制胃癌细胞EMT的发生，进而抑制胃癌细胞的侵袭转移，为研究EphA2在胃癌EMT中的作用提供了一定的理论基础，其具体机制有待进一步研究证实。

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Effect of silencing EphA2 expression on epithelial mesenchymal transition of gastric cancer AGS cells*

Hou Futao1，Huang Zhongcheng1，Chen Zihua2△
（1.Department of Gastrointestinal and Colorectal Anal Surgery，Hunan Provincial People′s Hospital，Changsha 410005，China；2.Department of Gastrointestinal Surgery，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008，China）

ObjectiveTo study the effect of EphA2 gene expression silencing on epithelial mesenchymal transition of gastric cancer AGS cells and its mechanism.MethodsThe gastric cancer AGS cells at logarithmic growth phase were inoculated at the 6-well plate and divided into the EphA2 siRNA group，negative control group and blank control group.EphA2 siRNA was adopted to transfected to gastric cancer AGS cells.The EphA2 expression was detected by real time quantitative PCR.The cell morphology was observed by phase contrast microscope.The invasive ability of transfected cells was determined by Transwell invasion assay.The expression of E-cadherin and vimentin protein was detected by Western blotting.ResultsThe EphA2 mRNA relative expression amount in the EphA2 siRNA group was 0.343±0.035，which was lower than 0.950±0.036 in the negative control group and 0.997±0.065 in the blank control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）；the gastric cancer AGS cells in the EphA2 siRNA group presented as the epithelioid cell，the cells in the negative and blank control groups showed the mesenchymal-like cells;the invasive cells number in the EphA2 siRNA group were 29.1±2.6，which was significantly less than 52.2±2.6 in the negative group and 56.2±4.0 in the blank control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）；the E-cadherin protein expression amount in the EphA2 siRNA group was significantly up-regulated compared with the negative group and blank control group，while the vimentin protein expression amount was significantly down-regulated，the differences were sta tistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe EphA2 expression of silencing AGS cells can inhibit the transition from epithelioid cells to mesenchymal like cells，reduces the invasive ability of AGS cells，up-regulates the expression of epithelial marker E-cadherin and down-regulates the expression of mesenchymal marker vimentin.

Stomach neoplasms； RNA； Gene expression； Proteins； Gene silencing； Epithelial cells； Biotransformation

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.24.002

：A

：1009-5519（2016）24-3744-03

2016-11-01）

国家自然科学基金资助项目（81172297）。

侯福涛（1983-），博士研究生，主要从事胃肠道肿瘤治疗研究。

△通讯作者，E-mail：122529274@qq.com。