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MAS育种改良籼稻恢复系‘E32’及其杂交种的稻瘟病抗性

2017-01-11刘金灵陈海龙杨丰宇黄俊廖花

作物研究 2017年1期
关键词:杂交种亲本抗病

刘金灵陈海龙杨丰宇黄俊廖花

(1湖南农业大学农学院,长沙410128;2水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室,长沙410128;3作物基因工程湖南省重点实验室,长沙410128;4南方粮油作物协同创新中心,湖南长沙410128)

MAS育种改良籼稻恢复系‘E32’及其杂交种的稻瘟病抗性

邹俊锋1,李永聪1,刘雄伦1,2,3,4*,刘金灵1,2,3,4,陈海龙1,杨丰宇1,黄俊1,廖花1

(1湖南农业大学农学院,长沙410128;2水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室,长沙410128;3作物基因工程湖南省重点实验室,长沙410128;4南方粮油作物协同创新中心,湖南长沙410128)

利用已克隆的广谱抗稻瘟病基因Pi9的DNA序列,设计功能分子标记Ins2-3,通过标记基因型辅助选择和连续回交育种实践,定向改良籼稻恢复系E32及其两系杂交种培矮64S/E32的稻瘟病抗性。获得以下结果:Ins2-3是一个高效共显性DNA标记,在Pi9供体亲本75-1-127和受体亲本E32基因组中分别扩增出一条793 bp和2 kb的稳定条带,Ins2-3的辅助选择效率达100%;利用Ins2-3开展分子标记辅助选择育种,通过连续多代回交自交,育成了苗瘟和穗瘟抗性均显著提高的新恢复系E32-Pi9,其遗传背景与受体亲本E32一致;用E32 -Pi9配制的两系杂交种培矮64S/E32-Pi9的稻瘟病抗性,比对照培矮64S/E32显著提高,而主要农艺性状及杂种优势表现非常相似。

水稻;稻瘟病抗性改良;Pi9基因;分子标记辅助选择

水稻是重要的粮食作物,全球一半以上人口以稻米为主食[1]。然而,作为水稻主要病害的稻瘟病(rice blast),可在水稻不同生育时期造成危害,流行年份可使水稻减产10%~30%,严重时甚至造成绝收[2]。由于多数杂交稻亲本的稻瘟病抗性不强,很大程度上限制了一些强优势组合的推广应用。长期实践表明,发掘、鉴定和利用广谱持久抗性基因,选育和推广抗病品种(组合)是控制稻瘟病害最经济、有效和安全的策略[3]。分子标记辅助选择(Molecular Marker-assisted Selection,MAS)育种可定向改良个别性状而不改变受体遗传背景,且没有转基因生物安全性风险,是现代分子育种的重要手段。来源于小粒野生稻的Pi9基因位于水稻第6号染色体的Pi2/9位点,与Pi2、Piz-t、Pigm、Pi50、Pi2-2等抗瘟基因互为复等位基因,是一个已被成功克隆的广谱持久抗性基因[4~9]。本研究利用Pi9基因序列设计并筛选高效DNA标记,并应用分子标记辅助选择育种技术开展连续回交育种,定向改良籼稻恢复系‘E32’及其杂交种的稻瘟病抗性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

Pi9基因供体亲本‘75-1-127’,受体亲本‘E32’;两系杂交种‘培矮64S/E32’,改良杂交种‘培矮64S/E32-Pi9’;稻瘟病室内接种抗病对照‘75-1-127’,感病对照品种‘CO39’;本实验室收集的来自国内外不同稻区的稻瘟菌小种或菌株25份(表1)。

1.2 方法

1.2.1 Pi9基因功能分子标记的开发

Pi9基因含有2个内元,长度分别为5362 bp和128 bp;cDNA全长4009 bp,包括3099 bp的编码区和910-bp 3′UTR[5]。利用Pi9基因序列信息设计分子标记,用候选标记分别PCR扩增75-1-127和E32基因组,做多态性分析,筛选出稳定高效的多态标记用于MAS育种。

1.2.2 供试水稻材料稻瘟病抗性鉴定及抗谱分析

室内接种水稻材料包括Pi9供体亲本‘75-1-127’、受体亲本‘E32’、改良品系‘E32-Pi9’、感病对照‘CO39’。供试水稻材料播种于塑料盆中,加入花卉营养土于人工气候室中育苗(26~28℃,正常光照)。4叶期采用单菌株约1×105个/mL浓度的稻瘟菌孢子悬浮液室内喷雾活体接种,26℃黑暗保湿24 h,然后在26~28℃、高湿、正常光照条件下诱导发病5~7 d。参照Bonman的0~5级标准调查病情并分类[10](0~2级为抗病类型,3~5级为感病类型),统计抗性频率。另外,所有水稻材料2016年5月14日播种于浏阳大围山病圃,6月中旬调查苗瘟,9月中旬调查穗瘟,鉴定田间抗性。

1.2.3 标记基因型分析

CTAB法提取水稻叶片总DNA[11]。用获选多态分子标记对各DNA样品做PCR扩增。PCR反应体系(10μL):DNA模板(约100 ng/μL)1.0μL,2 pmol/μL primer pairs 1.0μL,10×Buffer 1.0μL,2.5 mmol/L dNTPs 0.2μL,5 U/μL r-Taq酶(大连宝生物)0.1μL,ddH2O 6.7μL;PCR反应程序:95℃预变性4 min,95℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸2 min,35个循环,72℃延伸5 min。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳,分析带型(标记基因型)。

1.2.4 MAS育种实践

2010~2015年在长沙(夏季)和三亚(冬季),用‘E32’作受体亲本及轮回亲本、‘75-1-127’作Pi9基因供体亲本,杂交及连续回交自交,开展MAS育种实践。2015年获得BC6F3群体,在此基础上鉴定出含Pi9基因的抗病纯系‘E32-Pi9’,同年用两用不育系‘培矮64S’配制杂交种。

2 结果与分析

2.1 供试亲本水稻的稻瘟病抗性及抗菌谱

室内接种结果表明,Pi9基因供体‘75-1-127’的抗性强抗谱广,除了对来自日本的小种KOH和来自韩国的小种ROR1表现感病外,对其余来自国内外不同稻区的23个小种(菌株)均表现高水平抗性,抗性频率为92.0%;受体亲本‘E32’对11份小种(菌株)表现抗病,对其余14份小种(菌株)感病,抗性频率为44.0%,表明‘E32’的稻瘟病抗性水平低、需要改良;感病对照品种‘CO39’对所有25份供试小种(菌株)均表现感病,抗性频率为0(表1)。

表1 供试水稻亲本的稻瘟病抗菌谱比较Table1 Resistancespectrumofthetestedriceparents to25M.oryzaeisolates

2.2 高效多态分子标记的获得

经过反复设计与筛选,获得了1个高效的DNA标记Ins2-3,该标记位于Pi9基因第一个内元,为共显性分子标记。Ins2-3在Pi9基因供体‘75-1 -127’中扩增出793 bp的单一稳定条带,在受体亲本‘E32’中扩增出一条约2 kb的单一稳定条带(图1)。用Ins2-3在各回交世代开展的MAS育种实践中,其辅助选择效率可达100%(数据未发表),表明Ins2-3是一个高效可靠实用的分子标记。

2.3 水稻抗病新品系E32-Pi9的鉴定

为了获得含有Pi9基因的抗病纯系,用E32/75 -1-127的BC6F3株系为材料,通过Ins2-3的单株基因型分析和室内接种抗性表型鉴定,筛选出1个抗病纯系‘E32-Pi9’(图1)。‘E32-Pi9’不仅Pi9基因位点纯合,而且主要农艺性状和产量性状也已经稳定,与受体亲本‘E32’的遗传背景基本一致(数据未发表)。

图1 抗稻瘟病水稻纯系‘E32-Pi9’的鉴定Fig.1 Identificationofricepureline‘E32-Pi9’withhigh-levelblastresistance

2.4 ‘E32-Pi9’及其杂交种的稻瘟病田间抗性

为进一步检验抗病纯系‘E32-Pi9’及其杂交种的稻瘟病田间抗性,2016年对相应材料进行了病圃自然抗性鉴定。结果表明,‘E32-Pi9’及其杂交种‘培矮64S/E32-Pi9’均表现出高水平的苗瘟和穗瘟抗性(苗瘟0级,穗瘟1级),与供体亲本‘75-1-127’的抗性水平相当;而相应的受体亲本‘E32’及其杂交种‘培矮64S/E32’的田间抗性水平低(苗瘟4级、穗瘟5级)(图2)。说明用显性广谱抗瘟基因Pi9改良水稻稻瘟病抗性是行之有效的。另外,抗病杂交种‘培矮64S/E32-Pi9’的主要农艺性状及杂种优势表现,与对照‘培矮64S/E32’相当(数据未发表)。

图2 改良抗病品系‘E32-Pi9’及其杂交种的田间抗性表现Fig.2 Fieldblastresistanceperformanceofimprovedriceline‘E32-Pi9’anditshybrid

3 讨论

稻瘟病是水稻的主要病害,抗性育种是解决稻瘟病危害最有效的策略。实践证明,Pi9基因(位点)具有广谱持久抗性,且为显性遗传,在杂交水稻稻瘟病抗性育种中具有广阔的应用前景。水稻稻瘟病抗性是一个典型的质量—数量性状,抗病性表型既由基因控制又受环境影响,因此传统育种方法很难准确选择。而MAS育种不但准确、高效、安全,而且可以在早期选择,在抗病性育种中显示出独特优势。另外,高水平的稻瘟病抗性往往是多个基因共同作用的结果,而MAS育种转移的通常是整个基因位点(基因家族),效果比通过转基因法导入单个基因更好,我们的育种实践结果很好地证明了这一现象。

由于稻瘟病菌生理小种(菌株)的多样性及易变性,往往导致抗病水稻品种在不同稻区或年份间抗性不一致、不稳定,一定程度上限制了抗性基因和抗性品种的推广应用[12]。实践证明,将多个抗菌谱不同的抗瘟基因聚合到同一个水稻品种中,是培育广谱持久抗瘟新品种的良策[13,14]。本实验室同时在研究和利用另一个广谱抗瘟基因Pigm。Pigm与Pi9具有交叉抗菌谱,我们已经开展包括Pi9、Pigm在内的多个广谱抗瘟基因的聚合育种,旨在培育出抗谱更广、抗性更强更持久的水稻新品种(组合)[15~19]。

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Improving Blast Resistance of Rice Restorer‘E32’and Its Hybrid through Molecular Marker-assisted Selection

ZOUJunfeng1,LIYongcong1,LIUXionglun1,2,3,4*,LIUJinling1,2,3,4,CHENHailong1,YANGFengyu1,HUANGJun1,LIAOHua1

(1 College of Agronomy,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128,China;2 Key Laboratory of Hunan Province for Disease Resistance Breeding of Rice and Rapeseed,Changsha,Hunan 410128,China;3 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province,Changsha,Hunan 410128,China;4 Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops,Changsha,Hunan 410128,China)

To improve blast resistance of the indica rice restorer E32 and its hybrid,amolecularmarker,Ins2-3,was developed based on the DNA sequence of the cloned broad-spectrum blast resistance gene Pi9,and marker-assisted selection breeding practicewas implemented in thisstudy.Themain resultswere as follows:Ins2-3 was a co-dominantmarker,showing stable polymorphism between the Pi9 donor 75-1-127 and the receptor E32 by producing a793bp and a 2kb PCR band respectively,and the phenotype selection efficiency bymarkergenotype reached 100%.A new restorer line E32 -Pi9 and its hybrid Peiai64s/E32-Pi9,with high-level seedling and spike blast resistance and unchanged genetic background,were bred.

rice;blast resistance improvement;the Pi9 gene;molecularmarker-assisted selection

S511.034

A

1001-5280(2017)01-0011-04

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2017.01.03

2016 11 28

邹俊锋(1987-),男,硕士研究生,Email:zoujunfeng185@163.com;并列第一作者:李永聪(1986-),男,硕士研究生,Email:465655693@qq.com。*通信作者:刘雄伦,教授,Email:xionglun@hunau.edu.cn。

国家转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08001-002);湖南省科技重大专项(2015NK1001)。

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