广叶绣球菌多糖脱蛋白方法比较研究*

王宏雨，林 勇，林衍铨，廖剑华，曾 辉，张 迪（福建省农业科学院食用菌研究所，福建 福州 350014）

广叶绣球菌多糖脱蛋白方法比较研究*

王宏雨，林 勇，林衍铨，廖剑华，曾 辉，张 迪**
（福建省农业科学院食用菌研究所，福建 福州 350014）

采用水提醇沉法从广叶绣球菌子实体中提取绣球菌多糖，以多糖保留率、脱蛋白率和DPPH自由基清除率为指标，比较Sevag法、三氯乙酸法和树脂吸附法3种方法对广叶绣球菌多糖脱蛋白效果的影响和对纯化多糖的抗氧化活性的影响。结果表明，综合3个评价指标的结果，树脂吸附法蛋白具有较高的蛋白脱除率、较高的多糖保留率和较好的DPPH自由基清除率，效果最好，3种脱蛋白方法中广叶绣球菌多糖的最佳脱蛋白方法为树脂吸附法。

广叶绣球菌；脱蛋白；多糖；抗氧化活性

广叶绣球菌（Sparassis latifolia） 子实体洁白细嫩，鲜美可口，营养丰富，特别是子实体中含有的β-葡聚糖具有提高人体免疫力、抗肿瘤、免疫调节、促进伤口愈合、抗菌、抗炎、抗氧化等功效，在保健品、药品方面具有非常广阔的应用前景[1-5]。

广叶绣球菌多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌等生物学活性，有很好的研究与开发利用价值。提取的粗多糖通常含有较多蛋白质，与糖形成复合物，影响多糖性质和生物活性。因此，探寻1种脱蛋白效果较好，多糖损失率较低，对多糖生物活性破坏较小的脱蛋白方法尤为重要。

1 材料与方法

1.1 供试材料

广叶绣球菌子实体为福建省农业科学院食用菌研究所林衍铨研究团队提供。冷冻真空干燥，粉碎，过60目筛，备用。

1.2 试剂与仪器设备

试剂：DPPH购自日本WOKO公司，其余试剂均为国产分析纯。

仪器：Centrifuge 5804 R冷冻离心机；日立U1900紫外扫描分光光度计，日本Hitachi公司；L535-1台式低速离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；紫外可见分光光度计；真空冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；BS系列电子天平，北京赛多利斯系统仪器有限公司；超纯水器Milli-Q plus，Millipore公司。

1.3 实验方法

1．3．1 广叶绣球菌多糖提取

称取广叶绣球菌子实体干品粉末，按照料液比1∶5，80℃浸提3 h，滤渣加水再按相同步骤提取1次，合并2次滤液，离心，上清液减压浓缩后加入3倍体积95%的乙醇醇沉，8 000 r·min-1离心20 min取沉淀。沉淀真空干燥去除残余乙醇，即得到绣球菌粗多糖。

1．3．2 脱蛋白方法

Sevag法参照文献 [6]；三氯乙酸法参照文献[7]；树脂吸附法：所用树脂为大孔吸附树脂HZ-830，具体实验方法参照文献 [8-12]。

1．3．3 多糖含量和蛋白质含量测定

多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250法[13]。

1．3．4 DPPH自由基清除率测定

DPPH自由基清除率测定参照文献 [14]。

1．3．5 多糖保留率和蛋白质脱除率计算

多糖保留率（P1）公式为：

式中：m1表示脱色后多糖含量；m2表示脱色前多糖含量。

蛋白质脱除率（P2）公式为：

式中：m3表示脱色前蛋白质浓度；m4表示脱色后蛋白质浓度。

所得数据经SPSS17．0统计分析。

2 结果与讨论

2.1 3种脱蛋白方法脱蛋白率比较

3种脱蛋白方法蛋白质脱除率比较情况见图1。

图1 3种脱蛋白方法蛋白质脱除率比较Fig．1 Protein removal ratio of three deproteinazation technologies

由图1可以看出，广叶绣球菌多糖经过3种方法脱蛋白后，树脂吸附法的蛋白脱除率最高，可以达到86．87%。其次是TCA法，脱除率达到73．73%，蛋白脱除率最低的是Sevag法，脱除率为43．08%。

2.2 3种脱蛋白方法多糖保留率比较

3种脱蛋白方法多糖保留率比较情况见图2。

图2 3种脱蛋白方法多糖保留率比较Fig．2 Polysaccharide retention of three deproteinazation technologies

从图2可以看出，广叶绣球菌多糖经过3种方法脱蛋白后，树脂吸附法和TCA法多糖保留率较高，分别为80．49%和79．97%。Sevag法多糖保留率较低，保留率为72．60%。Sevag法是比较传统的脱蛋白方法，较为温和，对多糖的结构破坏不大，但去除蛋白质同时也会除去少量粘附的多糖，次数越多，损失也会越多，因此Sevag法的多糖损失率较高，保留率较低。

2.3 3种脱蛋白方法对抗氧化活性影响

3种脱蛋白方法抗氧化活性比较情况见图3。

图3 3种脱蛋白方法DPPH·清除率比较Fig．3 DPPH·scavenging capacity of three deproteinazation technologies

从图3可以看出，广叶绣球菌多糖经过3种方法脱蛋白后，TCA法脱蛋白的绣球菌多糖抗氧化活性最强，DPPH·清除率为58．78%；其次是树脂吸附法，DPPH·清除率为53．25%；最低的是Sevag法，DPPH·清除率为41．25%。TCA法和树脂吸附法能够在脱蛋白的同时保证绣球菌多糖的活性。

3 讨论

本实验采用蛋白质脱除率、多糖保留率和DPPH自由基清除率为评价指标，比较了Sevag法、三氯乙酸法、树脂吸附法3种脱蛋白方法对广叶绣球菌脱蛋白效果的影响。综合3个评价指标的结果，树脂吸附法具有较高的蛋白脱除率、较高的多糖保留率和较好的DPPH自由基清除率，效果最好。

三氯乙酸法脱蛋白是利用三氯乙酸与大分子蛋白质结合成不溶性盐形成沉淀，适用于除去蛋白含量较高的多糖，但其酸性较强，对多糖的结构破坏较大；Sevag法是比较传统的脱蛋白方法，较为温和，对多糖的结构破坏不大，但去除蛋白质同时也会除去少量粘附的多糖，因此Sevag法脱蛋白后多糖损失较多，次数越多，损失也会越多，因此Sevag法的多糖损失率较高，保留率较低。利用树脂吸附法脱除绣球菌多糖中的蛋白，蛋白质脱除率最高，多糖损失率最低，抗氧化活性较好。并且树脂吸附法脱蛋白过程没有用到有机溶剂，对多糖结构破坏小，不需要后期进行有机溶剂的去除与回收。此外树脂吸附法脱蛋白的同时可实现对多糖的脱色，树脂吸附工艺参数便于工业化扩大生产，具有很好的应用前景。

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Comparative Study on Deproteinization Technology of Sparassis latifolia Polysaccharide

WANG Hong-yu,LIN Yong,LIN Yan-quan,LIAO Jian-hua,ZENG Hui,ZHANG Di
（Institute of Edible&Medicinal Fungi,Fujian Academy of Agicultural Sciences,Fuzhou 350014,China）

To investigate the deproteinazation technology of Sparassis latifolia polysaccharides,the effect of different methods such as sevag method,trichloracetic acid method and resin method was evaluated in terms of the ratio of protein removal, polysaccharide retention and scavenging DPPH free radical．This study provided the resin method was better than the other two methods,with the hightest protein removal,higher polysaccharide retention and better DPPH free radical scavenging capacity．

Sparassis latifolia;deproteinization;polysaccharide;anti-oxidant activity

S646.9

A

1003-8310（2017）01-0063-03

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．01．015

福建省属公益类科研院所专项（2014R1020-5）；福建省属公益类科研院所专项（2014R1020-2）；福建省属公益类科研院所专项（2015R1020-7）。

王宏雨（1984-），女，硕士，助理研究员，主要从事食用菌提取加工技术研究。E-mail:wanghongyu0928＠126．com

**通信作者：张迪（1983-），男，硕士，助理研究员，主要从事食用菌天然产物研究。E-mail:photohost＠126．com

2016-11-22