力学刺激对软骨下骨修复过程中OPG/RANKL/RANK通路及破骨细胞的影响

朱鸿飞，褚立希，谭朝丹

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是生物学和力学因素共同作用下细胞外基质、软骨细胞、软骨下骨三者合成与分解失衡的结果，是一种以关节边缘和软骨下骨质再生以及关节软骨变性和丢失为特征的慢性骨性关节疾病。近年来，机械力学刺激在软骨下骨损伤修复以及重塑过程中的作用正日益受到关注。成骨细胞与破骨细胞的动态平衡是软骨下骨重塑与修复的关键，力学刺激对于成骨细胞的影响已有许多相关研究，而破骨细胞在骨修复过程中活性明显强于成骨细胞，近年来越来越多的学者对此已有关注，本文就力学刺激对软骨下骨修复过程中破骨细胞相关分子方面的作用机制予以综述。

1 破骨细胞与软骨下骨

软骨下骨承接着关节软骨向下传导的应力负荷，主要起到吸收应力、将应力负荷向关节的周围和下方传递，可以保护关节软骨以缓冲震荡，维持关节形状。目前，软骨下骨在未来的骨关节炎治疗中将发挥重要作用已得到众多学者的公认[1]。骨关节炎时，正常的力学传导平衡被打破，软骨下骨骨组织所承受的应力负荷明显增加，当超过骨小梁对于应力的缓冲能力的限度时，骨小梁会发生微骨折，持续的微骨折的积累导致关节软骨下骨及骨组织的损伤。为了修复损伤的骨组织，在异常应力和生物学作用下，骨皮质的纤维血管组织浸润钙化软骨，得以侵炎性组织入，继而活化破骨细胞，导致软骨内的骨化中心激活以及潮线扩张，加速软骨的退变。研究发现，OA软骨下骨中组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶-9 (Matrix Metalloproteinase-9，MMP-9)、细胞核因子kB受体活化因子配体(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand, RANKL)和抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase，TRAP)等骨吸收标记的基因表达水平增高，促进破骨细胞的增殖与活化，而破骨细胞凋亡及白细胞介素受体I型(Interleukin-1 Receptor I Type，IL-1RI)表达却下降，表现为骨重塑提高，骨吸收增加[2]。骨关节炎中，异常激活的成骨细胞和破骨细胞可引起软骨下骨的骨重塑，同时逆向影响上层软骨生物力学环境，进而导致上层软骨的退变。软骨下骨的修复与重塑取决于骨吸收与骨形成的平衡，在破骨细胞形成的同时成骨细胞也在增殖及分化。Sanchez等[3]对OA患者软骨下骨硬化区和非硬化区的成骨细胞施加大小为1MPa、频率为1Hz的周期性压应力，持续4h，结果RANKL和MMPs的表达均增加。但是，由于破骨细胞研究条件的局限性，骨关节炎中的破骨细胞影响软骨下骨重塑的作用机制，仍有待进一步研究。

2 破骨细胞与力学信号转导途径

2.1 破骨细胞的起源及信号调节通道 破骨细胞来源于造血干细胞的单核巨噬细胞谱系[4]，在骨吸收过程中起着非常重要的作用。研究发现，骨保护素(Osteoprotegerin,OPG) 是调控成骨细胞功能活动的重要分子，破骨细胞分化因子(Osteoclast Ddifferentiation Factor,ODF)是调控破骨细胞功能活动的重要分子。ODF又称为细胞核因子kB受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand RANKL),主要由成骨细胞合成,RANKL与破骨细胞表面的受体--细胞核因子κB 受体活化因子(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB，RANK)结合可增加破骨细胞的增殖，增加骨吸收。OPG/RANKL/RANK通路是成骨细胞与破骨细胞之间相互作用的信号通道，可调控骨吸收。OPG主要由间充质干细胞和成骨细胞合成和分泌,具有增加骨密度、抑制破骨细胞活性和降低破骨细胞分化的功能[5]，含有5 个外显子，其与肿瘤坏死因子受体(Tumor Necrosis Factor Receptor，TNF)的编码蛋白类似，属于TNF受体超家族。研究表明，OPG 基因被敲除的小鼠有骨小梁和骨皮质减少、骨质疏松严重等症状同时伴有OPG 转基因过度表达的小鼠则会出现骨硬化症[6]。RANKL是一种三聚体Ⅱ型跨膜蛋白，由317 个氨基酸构成，广泛表达于淋巴细胞、软骨细胞和成骨细胞中[7]。人类RANKL基因主要表达于骨髓、骨及淋巴组织。RANKL可结合破骨细胞表面受体RANK，具有促进破骨细胞分化、生成、活化成熟的作用，进而破坏骨质。 RANK属于TNF超家族成员，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，由616个氨基酸组成。RANK编码基因由29个氨基酸信号肽、细胞外编码区183 个氨基酸、跨膜区21个氨基酸和细胞质区383个氨基酸组成[8]。OPG可以通过竞争性地结合RANKL，阻碍RANKL与RANK结合，抑制破骨细胞活性，阻碍骨吸收。因此OPG/RANK/RANKL调节轴对于破骨细胞分化及骨重建的耦联作用非常关键。

2.2 力学刺激与OPG/RANKL/RANK信号通路 力学刺激作用于细胞后，细胞可通过细胞外基质-整合素-细胞骨架系统、钙离子通道、G 蛋白与酪氨酸激酶等多种途径将细胞外物理性的应力信号转变为细胞内的化学信号，传导至细胞核内，细胞核内的相关基因被活化，调控合成一些细胞因子，起到调控细胞增殖、分化、凋亡的作用。大量研究表明，OPG/RANKL/RANK信号通路是力学敏感通路[9]。在OPG/RANKL/RANK系统中，骨髓基质及成骨细胞在分泌RANKL使破骨细胞分化、促进骨吸收的同时也会分泌一定量的OPG 以防止骨过度吸收。OPG/RANKL比值下降时破骨细胞活性增强，骨吸收增加[10]。适宜的机械应力刺激和运动能促进OPG的表达，提高OPG/RANKL比例，有利于促进骨骼生长[11]。Boreham等[12]发现，有规律的耐力运动能使骨量明显增加1%～6%，提高成骨细胞活性，促进骨形成；而过度运动则抑制OPG 的表达，上调RANKL表达，OPG/RANKL比例下降，增强破骨细胞活性，导致骨微损伤[13]。这些实验都说明中等强度的应力刺激可引起OPG/RANKL比值升高，有利于促进骨形成；而大强度的应力刺激则引起OPG/RANKL比值下降，不利于骨骼发展。

3 力学刺激对破骨细胞的作用

3.1 机械应力抑制破骨细胞分化 骨骼处于动态发展状态，骨重建与修复均与生理或外加力学刺激相关，其中由成骨细胞与破骨细胞主导的骨形成和骨吸收在整个过程中保持动态平衡[14-15]。成骨细胞与破骨细胞密切相关，研究发现[16]，利用成骨细胞和破骨前体细胞共培养可诱导出更多的破骨细胞和高水平的Notch2表达，为进一步破骨细胞功能实验奠定基础。大量研究证实[17-19]，机械应力可直接抑制破骨细胞分化，并通过下调ODF及RANKL、MMP-9、组织蛋白酶-K、降钙素受体等骨吸收标志物的mRNA表达，上调内源性一氧化氮合酶(Endogenous Nitric Oxide Synthase，eNOS)mRNA表达，起到抑制骨吸收的作用。研究发现[20-21]，应力刺激可抑制破骨细胞分化，进而防止软骨及软骨下骨的退化，起到治疗关节炎的作用。力学刺激能通过骨细胞、成骨细胞间接调控破骨细胞的增殖及活性，且能直接作用于破骨细胞并产生生物效应，1000μs大小的循环压力可以增强成骨细胞的活性，同时促进BMSCs向成骨细胞分化，并抑制破骨前体细胞RAW264.7向破骨细胞分化。力学刺激会改变RANK与RANKL的结合度，从而抑制破骨细胞成熟、分化，减少骨吸收，其是调节破骨细胞增殖与分化的主要因子。巫松辉等[22]发现复合振动能通过抑制RANKL 诱导破骨细胞形成，下调破骨细胞特异基因组织蛋白酶K，MMP-9和TRAP的表达，达到抑制骨吸收的作用。应力刺激还可通过下调IL-1、TNF-α等炎性因子及TRAP、ODF、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、RANKL等骨吸收因子的表达，降低破骨细胞的增殖及分化能力，进而抑制骨吸收。Nagatomi等[23]发现周期性机械压力能下调IL-1及TNF-α等促进破骨细胞分化的细胞因子的基因表达，显著抑制骨吸收。但是，在目前环境下研究成骨细胞的相关量化条件是否适用于破骨细胞，仍有待进一步观察。

3.2 不同大小的力学刺激对破骨细胞的不同作用 骨的修复与重建需要力学刺激的参与，不同大小的力学刺激对于破骨细胞的作用不同。陈国仙等[24]观察不同频率振荡应力(3～10Hz、15～35Hz、35～45Hz、50～70Hz 和70～90Hz)分别作用于体外诱导分化的RAW264.7细胞，发现不同振动频率组破骨细胞特异性基因(TRAP、MMP-9和CATK)表达水平逐渐减低，而B、C、D组中OPG基因表达逐渐上调，同时RANKL基因的表达逐渐下调，说明RAW264.7细胞不同程度地被抑制向成熟破骨细胞增殖分化。刘应芬等[25]研究发现， 16.08dyne/cm2的剪切力作用30min可使TRAP活性最强，同时通过扫描电镜观察发现吸收陷窝的面积和数量均有较为明显的提升，促进了破骨细胞的吸收活性。力学环境是影响骨组织细胞增殖、分化和凋亡的重要因素，许多学者在骨的生物学和力学方面做了大量研究工作。2500 με被认为是生理范围内的应变，3000～5000με是生理性过载应变，生理性过载应变水平下长期循环加载或超过5000με为病理过载，会引起病理性骨重塑与重建。在一定的作用时间内，较高强度的生理载荷促进破骨细胞分化和功能，低强度载荷抑制破骨细胞分化，病理性载荷抑制破骨细胞分化[26]。研究还发现，不同强度周期性应变力对分化初期破骨前体细胞和已分化的破骨前体细胞的破骨分化和功能状态的影响有明显差异，2500με的周期性应变力可显著抑制成骨细胞+破骨细胞共培养体系中破骨细胞的分化功能，减少骨吸收[27]。

4 展望

力学刺激改善骨修复的可能途径为一定大小及频率的应力上调OPG、IFN等成骨因子的表达以促进骨形成，同时下调RANKL等骨吸收因子的表达抑制骨吸收。有关应力信号如何分别影响和交互影响骨形成和骨吸收过程从而影响软骨下骨的作用机制还有待进一步的探索和研究。因此，研究通过适宜应力刺激调节或直接靶向干预破骨细胞及OPG/RANKL/RANK系统来治疗骨关节炎既是机遇又是挑战。

[1] Castaneda S,Roman-Blas JA, Largo R, et al. Subchondral bone as a key target for osteoarthritis treatment. Biochem Pharmacol, 2012, 83(3): 315-323.

[2] Durand M, Komarova SV, Bhargava A,et al. Monocytes from patients with osteoarthritis display increased osteoclastogenesis and bone resorption: the In Vitro Osteoclast Differentiation in Arthritis study [J]. Arthritis Rheum, 2013, 65(1): 148-158.

[3] Sanchez C, Pesesse L, Gabay O, et al. Regulation of subchondral bone osteoblast metabolism by cyclic compression [J]. Arthritis Rheum, 2012, 64(4):1193-1203.

[4] 田雪飞.破骨细胞的来源[J].国外医学: 口腔医学分册,2002,29(4): 354-356.

[5] Harada S, Takahashi N. Control of bone resorption by RANKL-RANKsystem [J]. Clinical calcium,2011, 21(8): 1121-1130.

[6] Dempster DW, Lambing CL, Kostenuik PJ, et al. Role of RANK ligand and denosumab, a targeted RANK ligand inhibitor, in bone health and osteoporosis: a review of preclinical and clinical data [J]. Clin Ther, 2012, 34(3): 521-536.

[7] Ryser MD,Qu Y, Komarova SV. Osteoprotegerin in bone metastases: mathematical solution to the puzzle [J]. PLoS computational biology, 2012, 8(10):1-12.

[8] Anastasia P, Ioannis P, Kelly M, et al. High levels of synovial fluid osteoprotegerin(OPG) and increased serum ratio of receptor activator of nuclear factor- kB ligand (RANKL) to OPG correlate with disease severity in patients with primary knee osteoarbritis [J]. Clin Biochem,2008, 41(9): 746-749.

[9] Zhang Y, Paul EM, Sathyendra V, et al. Enhanced osteoclastic resorption and responsiveness to mechanical load in gap junction deficient bone [J]. PLoS One, 2011, 6(8): 1-12.

[10]Novack DV. Role of NF-kappaB in the skeleton[J]. Cell Res,2011, 21(1) : 169-182.

[11]Thompson WR, Rubin CT, Rubin J. Mechanical regulation of signaling pathways in bone[J]. Gene, 2012, 503(2) : 179-193.

[12]Boreham CA,Mckay HA. Physical activity in childhood and bone health [J]. British journal of sports medicine, 2011,45(11) : 877-879.

[13]Mulcahy LE, Taylor D, Lee TC, et al.RANKL and OPG activity is regulated by injury size in networks of osteocyte-like cells[J].Bone,2011,48(2) : 182-188.

[14]廖乃顺,陈文列,黄云梅,等.成骨细胞与破骨细胞共培养及其应用研究进展[J].中国骨伤,2013,26(4):349-353.

[15]Takano Yamamoto T.Osteocyte function under compressive mechanical force[J].Jap Dental Sci Rev,2014,50(2):29-39.

[16]段莉,郑根建.两种不同细胞培养方法对破骨细胞分化及Notch2基因表达的影响[J].海南医学院学报, 2012,18 (8) :1009-1012.

[17]Rubin J, Murphy T, Nanes MS, et al. Mechanical strain inhibits expression of osteoclast differentiation factor by murine stromal cells [J]. AmeJ Physiol Cell Physiol, 2000, 278(6) : 1126-1132.

[18]Rubin J, Murphy TC, Zhu L, et al. Mechanical strain differentially regulates endothelial nitric-oxide synthase and receptor activator of nuclear kappa B ligand expression via ERK1 /2 MAPK[J].J Biol Chem,2003,278(36) : 34018-34025.

[19]Suzuki N, Yoshimura Y, Deyama Y, et al. Mechanical stress directly suppresses osteoclast differentiation in RAW264. 7 cells[J].Int J Mol Med, 2008, 21(3) : 291-296.

[20]Xinle Li, Jing Yang, Daquan Liu, et al. Knee loading inhibits osteoclast lineage in a mouse model of osteoarthritis[J].Scientific reports,2016,20(6):24668-24672.

[21]Guo Y, Wang Y, Liu Y,et al.Effect of the same mechanical loading on osteogenesis and osteoclastogenesis in vitro[J].Chin J Traumatol,2015,18(3):150-156.

[22]巫松辉,钟招明,查丁胜,等.复合振动抑制RAW264.7 细胞分化成熟[J].中国骨质疏松杂志,2011,17(7): 564-567.

[23]Nagatomi J, Arulanandam BP, Metzger DW, et al. Effects of cyclic pressure on bone marrow cell cultures [J]. J Biomechan Eng, 2002, 124(3) : 308-314.

[24]陈国仙,陈建庭,黄文华,等.不同频率振动应力对破骨细胞特异性基因及骨保护素/核因子κB 受体活化因子配体表达的影响[J].中国康复医学杂志,2014,29(2):99-103.

[25]刘应芬,李红,吴江,等.流体剪应力对大鼠破骨细胞骨吸收活性的影响[J].生物医学工程学杂志,2007,24(3) :544-548.

[26]郭勇,郭春,闫玉仙,等. 周期性张应变对破骨前体细胞和破骨细胞增殖和抗酒石酸酸性磷酸酶的影响[J]. 医用生物力学,2012,27(3):29-304.

[27]YAN YX,GONG YW,Guo Y,et al.Mechanical strain regulates osteoblast proliferation through integrin mediated ERK activation[J].PLoS ONE,2012,7(4):35709-35715.