氯化甲基汞蓄积对成年大鼠记忆功能及脑组织MBP的影响

胡怀强 吕伟 唐吉刚 王树才 曹秉振

(中国人民解放军济南军区总医院神经内科，山东 济南 250031)



氯化甲基汞蓄积对成年大鼠记忆功能及脑组织MBP的影响

胡怀强 吕伟 唐吉刚 王树才 曹秉振△

(中国人民解放军济南军区总医院神经内科，山东 济南 250031)

目的 探讨氯化甲基汞(MMC)对成年大鼠记忆功能及脑组织髓鞘碱性蛋白(MBP)的影响。方法 通过灌胃给予大鼠不同剂量的MMC，采用水迷宫观察大鼠记忆功能，采用免疫组织化学方法观察不同时间点各组大鼠脑组织MBP的变化。结果 MMC增加学习及记忆潜伏期，大剂量组脑组织MBP与其它各组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 MMC可引起成年大鼠记忆功能损害，髓鞘破坏可能是其导致记忆损害的机制之一。

氯化甲基汞； 记忆功能； 髓鞘碱性蛋白； 认知障碍

汞是环境中常见的重金属毒物之一，经过水系食物链的生物富集作用及微生物甲基化作用使海产品中含有相当量的甲基汞。甲基汞是持续性有机污染物，极易透过血脑屏障，具有强烈的神经毒性作用[1]。脑组织比其他组织具有更丰富的脂质成分，加之耗氧量高，成为汞的主要靶器官之一[2]，为进一步观察氯化甲基汞(MMC)对成年大鼠记忆功能的影响及其机制，我们观察了不同剂量MMC在大鼠体内蓄积时间不同对其记忆功能和脑组织髓鞘碱性蛋白(MBP)的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年SPF级雄性SD大鼠120只，体质量250～300 g，由山东鲁抗医药股份有限公司质监中心实验动物室提供，证实验动物质量合格证号：鲁动质号0005957(山东省实验动物管理委员会发)，检疫后备用，自由摄食进水。实验过程中动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。

1.2 试剂设备 MMC由德国Labor Dr. Ehrenstorfer Schaefers公司提供，Rabbit MBP由武汉博士德生物工程有限公司提供，浓缩型DAB试剂盒由北京中杉金桥生物科技有限公司提供，Morris水迷宫由中国医学科学院药物研究所生产。

1.3 实验方法

1.3.1 分组造模 实验动物购买后，在实验室内预适应饲养1周，1周后随机分为：对照组、A组[MMC小剂量组(0.5 mg·kg-1·d-1)]、B组[MMC中剂量组(1 mg·kg-1·d-1)]、C组[MMC大剂量组(2 mg·kg-1·d-1)]共四个大组，每个大组30只；并根据观察时间每组又分为1周、2周、4周共三个亚组，每个亚组动物数为10只。正常对照组：自由饮食，不做任何干预。氯化甲基汞小、中、大剂量组组分别给予不同剂量氯化甲基汞。

1.3.2 行为记忆观察 每周称量各组大鼠体质量并做记录，观察各组大鼠进食量、反应能力及毛色变化。Morris水迷宫作为检测实验大鼠学习记忆水平的工具，其测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。

1.3.3 免疫组化检测脑组织MBP 取各组大鼠脑组织，用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，取相同层面切片用免疫组织化学染色方法观察脑组织MBP的阳性表达，运用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统进行分析，记录平均阳性细胞数。

2 结 果

2.1 MMC对大鼠记忆功能的影响

2.1.1 Morris水迷宫实验学习潜伏期研究 结果见表1。

组别1周2周4周对照组25．21±2．1326．18±3．7226．85±4．16A组28．23±4．6832．34±5．73△42．87±6．53▲★B组30．73±5．4441．57±7．96▲◆▼65．35±8．23▲◆★C组35．26±6．31▲◇59．82±7．33▲◆※▼———

注：与同时间点正常对照组比较，△P<0.05、▲P<0.01；与同时间点小剂量组比较，◇P<0.05、◆P<0.01；与同时间点中剂量组比较，※P<0.01；组内与1周时比较，▽P<0.05、▼P<0.01；组内与2周时比较，☆P<0.05、★P<0.01。

2.1.2 Morris水迷宫实验记忆潜伏期研究 结果见表2。

组别1周2周4周对照组16．35±3．4816．72±4．0116．72±4．01A组20．67±4．8226．33±5．24▲▽37．48±7．37▲★B组29．31±5．21▲◆35．84±6．78▲◆▽43．19±7．56▲◇☆C组33．68±5．62▲◆42．25±6．83▲◆※▼———

注：与同时间点正常对照组比较，▲P<0.01；与同时间点小剂量组比较，◇P<0.05、◆P<0.01；与同时间点中剂量组比较，※P<0.05；组内与1周时比较，▽P<0.05、▼P<0.01；组内与2周时比较，☆P<0.05、★P<0.01。

2.2 MMC对大鼠脑组织MBP的影响 免疫组织化学染色检测大鼠脑组织MBP的表达，显示阳性细胞表达呈棕黄色，结果见表3。

组别1周2周4周对照组32．18±3．8330．54±2．9633．76±4．01A组29．43±3．9626．42±4．17△20．17±3．87▲★B组27．37±3．28△22．19±3．42▲◇▼16．48±3．03▲◇★C组25．85±3．77▲17．68±3．92▲◆※▼10．11±4．36▲◆●★

注：与同时间点正常对照组比较，△P<0.05、▲P<0.01；与同时间点小剂量组比较，◇P<0.05、◆P<0.01；与同时间点中剂量组比较，※P<0.05、●P<0.01；组内与1周时比较，▼P<0.01；组内与2周时比较，★P<0.01。

3 讨 论

神经行为测试是近年来发展起来的一种评价神经毒物所致神经系统损伤的方法。Morris水迷宫应用于学习记忆脑机制研究[3]，在空间定位航行试验中，通过对其所处环境标志物体的空间位置进行比较、评价，从而学会寻找水迷宫中的平台，并爬上平台以逃避溺死，获取经验(学习)的能力以逃避潜伏期即从大鼠入水至找到并爬上平台所需时间来表示。空间搜索能力是以撤除平台后大鼠经过水迷宫平台原址的次数来表示，因为需要精确地定位原平台所在的位置，故可作为大鼠保存经验(记忆)的能力的敏感指标[4]。因此本实验运用Morris水迷宫来研究学习记忆能力的改变是比较恰当的。本研究表明，MMC暴露组的学习潜伏期和记忆潜伏期较正常对照组明显延长，同一观察时间点给予MMC的剂量越大其潜伏期越长，同一组的MMC中毒大鼠随着时间的延长其学习、记忆潜伏期均明显延长，经统计学分析均有显著性差异，由此可见大鼠的学习记忆能力与体内汞的蓄积量呈显著剂量效应关系。结合不同训练段数的各组大鼠游泳路线图可以发现，对照组能较迅速地找到平台，其游泳距离也最短，可见对照组定位能力和趋向性较好，游泳轨迹以目标象限为主；而汞暴露组定位能力和趋向性较差，游泳轨迹比较分散，找到平台的时间更长，游程也更长，并存在剂量效应关系。本研究与S.B.Fountain[5]等研究结果相似，甲基汞暴露可显著抑制海马区突触传递及其兴奋性，并且存在剂量效应关系。刘苹[6]等研究也发现低浓度汞(甲基汞)可导致动物的神经行为发生变化，出现学习和记忆能力的下降。

MBP是神经髓鞘特有的膜蛋白，广泛存在于少突胶质细胞及其髓鞘中的骨架蛋白，是维持神经元髓鞘结构和功能稳定的重要物质基础，具有屏闭、支持、营养等作用。髓鞘的产生和维持对于大脑正常行使功能是必要的。研究[7]表明，血管性痴呆患者存在髓鞘损伤性病变，并且其MBP含量高低与髓鞘损伤严重程度密切相关。因此，MBP水平变化可反映脑白质少突胶质细胞髓鞘损伤的严重程度，是CNS损害和急性脱髓鞘的客观生化指标[8]，对判断病情严重程度和预后有重要意义。在本研究中我们动态观察了不同剂量下在不同时间点氯化甲基汞对大鼠脑组织MBP的影响，结果显示随着汞在大鼠体内的蓄积其脑组织中的MBP明显减少，且具有剂量时间依赖性，并具有统计学意义，表明汞可以明显损害中枢神经系统髓鞘碱性蛋白。研究表明氯化甲基汞可显著损害少突胶质细胞髓鞘，这可能是导致大鼠记忆功能障碍的主要机制之一。

[1] Rocha JB, Rocha LK, Emanuelli T, et al. Effect of mercuric chloride and lead acetate treatment during the second stage of rapid post-natal brain growth on the behavioral response to chlorp romazine and on delta-ALA-D activity in weaning rats [J]. Toxicol Lett, 2001, 125(1-3): 143-150.

[2] 吴敌，林世和，赵节绪，等. 金属汞中毒颗粒在鼠脑神经细胞的沉积[J]. 中华神经科杂志，2000，33(2)：110-111.

[3] Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat [J]. J Neurosci Methods, 1984, 1(1): 47-60.

[4] Fischer W, Chen KS, Gage FH, et al. Progressive decline in spatial learning and integrity of forebrain cholinergic neurons in rats during aging [J]. Neurobiol Aging, 1992, 13(1): 9-23.

[5] Fountain SB, Rowan JD. Effects of sequential exposure tomultiple concentrations of methylmercury in the rat hippocampal slice [J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2000, 47(2): 130-136.

[6] 刘苹，李健，吴锡南，等. 甲基汞对亲仔两代大鼠的神经行为毒性效应[J]. 环境与健康杂志，2001，18(6)：339-342.

[7] 文志华，魏佳军，袁先厚，等. 血管性认知损害与S100β和髓鞘碱性蛋白的关系[J]. 中国脑血管病杂志，2007，4(1)：10-13.

[8] Wunderlich MT, Wallesch CW, Goertler M. Release of neurobiochemical markers of brain damage is related to the neurovascular status on admission and the site of arterial occlusion in acute ischemic stroke [J]. J Neurol Sci, 2004, 227(1): 49-53.

Effect of Methyl-mercuric Chloride on Memory and MBP of Adult Rats in Different Courses

HuHuaiqiang,LvWei,TangJigang,WangShucai,CaoBingzhen.

DepartmentofNeurology,TheGeneralHospitalofJinanMilitaryCommand,Jinan250031,China.

Objective To investigate the effect of methyl-mercuric chloride (MMC) on memory and MBP of adult rats in different courses. Methods The changes of memory were observed by water maze. The changes of MBP were detected by immunohistochemistry at different times after administrating various dosages. Results MMC significantly increased the latency of study and memory. MMC significantly inhibited MBP, which of large dose group there were statistical significantly differences compared with those of other groups (P<0.01). Conclusion MMC can impair the memory of adult rats, myelin sheath damage is one of the mechanism, which effects are dose and time dependent.

Methyl-mercuric chloride; Memory; Myelin basic protein; Cognitive impairment

中国博士后科学基金资助(项目编号：20080431409)

R114

A

1000-744X(2016)03-0241-02

2015-10-27)

△通信作者,E-mail：cbzxia2011@163.com