LncRNA在恶性脑胶质瘤中的研究进展

汪翔 吴强 李庆中 李维平

(1安徽医科大学附属深圳市第二人民医院临床医学院; 2深圳市神经外科重点实验室，广东 深圳 518000)

·综述·

*通讯作者：李维平，主任医师，E-mail: liweiping60@yahoo.com.cn

LncRNA在恶性脑胶质瘤中的研究进展

汪翔1吴强1李庆中2李维平*

(1安徽医科大学附属深圳市第二人民医院临床医学院;2深圳市神经外科重点实验室，广东 深圳 518000)

长链非编码RNA; 恶性脑胶质瘤; 生物标志物

一、背景

恶性脑胶质瘤(malignant glioma, MG)是成人最常见的原发性颅内肿瘤，占中枢神经系统原发恶性肿瘤的近80%且预后很差，其在成人患者中的平均生存期只有14.6个月。全世界范围内每年约有20万名患者被新诊断为恶性脑胶质瘤，然而这一数据还有逐年上升的趋势[1]。传统治疗恶性脑胶质瘤的首选方法是手术切除，再辅以化疗、放疗或综合放化疗。然而，由于恶性胶质瘤的侵袭性生长特性会与瘤周正常脑组织结合紧密，外科手术很难彻底的清除肿瘤。另一方面，虽然化疗可以延长患者的生存期，但临床上总体疗效仍不理想[2-3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是近年研究人类基因组时被发现的一类长度大于 200个核苷酸的非编码 RNA(Non-coding RNA, NcRNA)，他们没有编码蛋白质的能力，而是以RNA的形式通过多种途径调控基因的表达包括肿瘤基因。已发现有关LncRNA在恶性脑胶质瘤发生发展过程中起到关键性的调节作用[4]。本文就LncRNA在恶性脑胶质瘤发病机制及预后中可能起到的调节作用进行综述。

二、LncRNA的生物学特征及与肿瘤的关系

NcRNA以不同类型如长链ncRNA(long ncRNA, LncRNA)和短链ncRNA (short ncRNA, SncRNA) 的形式广泛存在于多细胞生物的基因组中，他们几乎参与了所有的细胞进程。其中LncRNA属于一种新型异构ncRNA类别,包括成千上万的不同转录本。近年来,研究者们在24种组织和细胞类型中利用RNA高通量测序定量分析LncRNA的表达差异，发现在结构上LncRNA可分为内含子非编码RNA(intronic ncRNA)与基因间ncRNA(lincRNA)，其中，内含子非编码RNA与编码蛋白质基因序列之间有交叉，其可以正性或负性的调节宿主编码蛋白基因的转录方向，而lincRNA是指蛋白编码基因位点之外的基因间ncRNA[5]。同时LncRNA的生成途径与蛋白编码基因也相似，他们有着相似的组蛋白修饰谱、剪接信号和长度相近的外显子或内含子。然而，与蛋白编码基因不同的是，LncRNA更倾向于从包含有两个内含子的基因转录而来。这些 LncRNA主要坐落在核染色质,其中一小部分似乎更倾向于被加工成SncRNA。与以前对LncRNA功能认识不同的是其不再被认为是转录过程中的副产物，大量研究证实了他们在细胞生长、分化以及多能干细胞的维护和癌症的发病过程中起着重要的调节作用。同时，LncRNA与核结构的互动中涉及众多基础的生物学机制，如剂量补偿(dosage compensation)、基因组印迹(genomic imprinting)和组蛋白修饰(histone modification)等，以上这些生物学机制都是通过顺式调节或反式调节基因表达来实现。虽然大多数的LncRNA功能仍有待确定[6]。但目前发现，LncRNA与肿瘤联系密切且其在恶性脑胶质瘤中是通过LncRNA的异常表达促进该肿瘤的进展[7]。

三、LncRNA在恶性脑胶质瘤中的双重作用

1.提高恶性脑胶质瘤的发生率及迁移、侵袭能力：核富集转本1(nuclear enriched abundant transcript 1, NEAT1)是一种具有高度调节能力的LncRNA，对核体旁斑形成非常重要，已被证实NEAT1在人类恶性肿瘤包括白血病和卵巢癌可选择性表达，并在肿瘤发生过程中发挥重要的作用，但在恶性脑胶质瘤中还没有完全被探索清楚[8]。于是Li等[1]对15例恶性脑胶质瘤患者的病变组织进行细胞转染后，再通过实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, RT-qPCR)分析发现NEAT1在恶性脑胶质组织表达上调，敲除NEAT1可以减少肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力。免疫沉淀反应测定RNA结合荧光素酶报告证实NEAT1上绑定着小RNA449b-5p (miRNA-449b-5p)并对其起着“分子海绵”(molecular sponge)样作用，即可以负性调节miRNA-449b-5p的表达。众所周知肿瘤促癌基因间质表皮转化因子基因(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor gene, c-Met)是miRNA-449b-5p下游的一个直接作用位点，当miRNA-449b-5p表达下调时c-Met的表达量就会升高，从而提高了恶性脑胶质瘤的发生率。由此可以得知NEAT1是通过miRNA-449b-5p/c-Met轴在MG细胞中表达而产生致癌性，这种调节机制提高了恶性脑胶质瘤的发生率。总的来说，NEAT1通过miRNA-449-5p在恶性脑胶质瘤中扮演着致癌基因的角色，该基因可能为恶性脑胶质瘤的治疗和预后提供了一个潜在的靶点[9]。

另一方面Shi等结合胶质瘤级别对158例脑胶质瘤中基因间长链非编码基因H19(long intergenic non-protein coding RNA H19, H19)的表达进行了统计学分析，发现H19在高级别胶质瘤中的表达明显高于低级别胶质瘤，同时H19的表达水平随着胶质瘤级别的升高而提升。为明确H19在恶性脑胶质瘤细胞中的生物学作用，研究者通过体外培养恶性脑胶质瘤细胞株U87和U251，并构建H19的小干扰RNA(siRNA)来抑制H19的表达。结果显示siRNA抑制H19表达后，两种恶性脑胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力都显著降低[10]。他们因此认为H19可能作为小非编码RNA675(miR-675)的前体发挥促进胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的作用。另外，在研究过程中还发现miR-675在脑胶质瘤细胞中也明显高表达，且其在高级别胶质瘤中的表达量高于在低级别胶质瘤，而且H19与miR-675在恶性脑胶质瘤中的表达也呈正相关。当抑制H19后miR-675的表达量也下降，并抑制了肿瘤细胞的侵袭能力。为了进一步探讨miR-675抑制肿瘤细胞侵袭的分子学机制，研究人员应用生物学软件分析后初步选定钙粘着蛋白13(cadherin 13)为其靶基因。深入研究发现miR-675与cadherin13在恶性脑胶质瘤中的表达密切相关，荧光素酶试验证miR-675对cadherin 13有直接调控作用[11]。另外，Jiang等[12]也做了类似的研究，他们利用30例恶性脑胶质瘤患者中获得的肿瘤和正常脑组织标本以及这些患者的生存数据,并通过RT-qPCR检测两种组织中的H19表达水平发现胶质母细胞瘤组织中H19的表达显著升高，且表达水平与患者生存期相关。随后，研究者使用脑胶质瘤细胞株U87和U373来探索H19在肿瘤细胞侵袭以及血管生成中的作用，在体外肿瘤细胞侵袭实验中证实了H19过表达可以促进脑恶性胶质瘤细胞的侵袭和血管生成能力，该发现可能使H19成为未来胶质母细胞瘤治疗的一个靶点。

2.抑制恶性脑胶质瘤细胞的增殖及迁移：X-无效的特异性转录物(X-inactive specific transcript, XIST)作为LncRNA的一种类型，源于xist基因的转录产物，其对哺乳动物X染色体失活起到了重要的调节作用，其中XIST在活动的X染色体中能被广泛的转录。有大量的证据表明XIST在人类细胞分化、增殖和基因组修复起着至关重要的作用，其异常表达推动着癌症的进展，这一作用可能与异染色质的稳定性改变以及基因表达的变化有关。已经发现在一些人类癌症中如血液系统肿瘤，XIST表达异常。有研究表明XIST对造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)的长期生存至关重要。然而XIST对胶质瘤干细胞(glioblastoma stem cell, GSC)的影响及其作用机理知之甚少[13]。因此Yao等[14]就人类恶性胶质瘤干细胞中XIST的功能和可能的致癌机制进行了研究，发现XIST在恶性脑胶质瘤组织和GSCs中表达上调。当敲除XIST时肿瘤细胞可通过减少增殖和转移以及诱导肿瘤细胞凋亡等途径发挥着肿瘤抑制功能，从而达到抑制肿瘤生长和提高生存期的作用。进一步研究发现XIST与miR-152可以相互抑制，XIST是miR-152的一个功能结合位点，而miRNA152是通过一种称为RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC)的核糖核蛋白复合物发挥基因沉默功能。当XIST敲除后，miR-152将在恶性脑胶质瘤细胞中的发挥肿瘤抑制作用。这也预示着LncRNA-miRNA的识别模块将会成恶性脑胶质瘤患者新的治疗靶点，并可进一步评估患者的预后。

四、LncRNA减缓恶性脑胶质瘤恶性进展

Loewer等[15]在诱导人类多能干细胞分化和识别过程中发现了大量多能性表达相关的大型基因间非编码重组转录RNA(reprogramming-related long noncoding RNA, LincRNA-RoR)，即重编程相关LncRNA。细胞LincRNA-RoR的表达活化可以促进细胞多能性的出现。因此LincRNA-RoR可以被当做诱导多能干细胞形成的一个关键促进因素，同时也可以是多能干细胞重组和分离的一个调节器。在此基础上Feng等利用RT-qPCR分析26位MG患者LincRNA-RoR、SOX11和表皮锌指因子4(kruppel-like factor 4, KLF4)的表达量并进一步分析它们表达量之间的相关性，发现与邻近正常组织相比MG组织的LincRNA-RoR表达量明显下降。而通过siRNA敲除lincRNA RoR之后，细胞侵袭能力显著提高并增强了CD133的表达，这导致胶质瘤干细胞球面形成(sphere-forming)的能力显著提高，这将增加该肿瘤发生的几率[16]。但过度表达lincRNA-RoR反而会降低以上的效应。另一方面LincRNA-RoR可通过负反馈调节KLF4从而起到抑制癌细胞扩散和胶质瘤干细胞自我更新的作用。这暗示着LincRNA-RoR可能是作为恶性脑胶质瘤的一个肿瘤抑制基因来抑制癌细胞的扩散和胶质瘤干细胞的自我更新，这为未来临床提供了一种新型生物标志物。另一个能够减缓MG恶性进展的LncRNA是癌症易感性候选2(casc2)，该基因位于染色体10q26的位置，现已被定性为子宫内膜癌和结直肠癌的肿瘤抑制因子[17]。最近Wang等[18]确认casc2在人恶性脑胶质瘤组织中低表达。它的过表达将会抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力，以及促进肿瘤细胞凋亡的作用。进一步研究发现上调casc2会明显抑制miR-21的表达，而miR-21已被证实在MG中高表达并起到促进其恶性进展的作用。此外生物信息学、荧光素酶报告分析和下拉实验分析了casc2和miR-21内在联系，发现了miR-21是以序列特异性的方式结合在casc2上，casc2通过 miR-21来发挥负性调节作用。在MG中，casc2发挥肿瘤抑制作用是通过负调控miR-21，这为治疗MG提供了一个新的方向。

五、LncRNA作为评估恶性脑胶质瘤预后的指标

肺腺癌转移相关转录子1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1)作为肺癌转移的预后因子已被人们所熟知。Ma等[19]对MALAT1在MG发病机制中所起的作用进行了探索，他们在分析MALAT1表达量与MG临床病理特征之间的关系时发现，与MG邻近正常脑组织相比，该肿瘤组织中的MALAT1表达量明显增加且其表达水平与MG的 WHO分级和体积正相关。因此发现MALAT1的过度表达可能会加速MG的生长，并提高肿瘤细胞入侵和转移的能力，其机制可能是MALAT1能够调节细胞转移和细胞周期相关的基因表达。此外，MALAT1表达与恶性脑胶质瘤患者总生存期呈逆相关关系：MALAT1表达量越高，MG患者的总体生存时间越短。因此，MALAT1可以作为MG患者的一个独立不良预后因素。另一个与恶性脑胶质瘤预后密切相关的LncRNA是同源异形框转录反义基因RNA(hox transcript antisense intergenic RNA, HOTAIR)，有研究发现HOTAIR的表达与脑胶质瘤级别和预后也密切相关。多变量Cox回归分析显示HOTAIR是MG患者的一个独立预后因素，证实HOTAIR表达与MG分子亚型以及癌症基因组图谱密切相关，即MG细胞中HOTAIR表达与其恶性等级呈正相关，同时其恶性程度越高患者的预后就越差。另外HOTAIR的表达参与了MG细胞周期的进程，其中HOTAIR的低表达会抑制MG细胞克隆增值，阻止细胞周期G0/G1的进展，以及抑制了原位肿瘤的生长。反之HOTAIR的高表达会相对促进MG生长，这将会使患者的生存期大大缩短，因此可以得出，HOTAIR可以作为MG的分子亚型标志物，以及细胞周期的重要调节器，更重要的是可作为恶性脑胶质瘤患者生存预后的评估因素[20]。与此研究不谋而合的是Ke等[21]利用定量PCR技术也证实了HOTAIR在恶性脑胶质瘤组织细胞中表达上调，随后他们证实HOTAIR的敲除在MG细胞中发挥着肿瘤抑制功能。其机制可能是miR-326是HOTAIR的一个作用靶点，当HOTAIR低表达时会导致miR-326的表达上调，随后激活 PI3K/AKT 和 MEK 1/2信号通路从而减少成纤维细胞生长因1(fibroblast growth factor 1, FGF1)的表达，而fgf1基因是MG的一个癌基因，在MG中扮演致癌的角色，即HOTAIR可通过miR-326介导MG细胞的恶性生物学行为。因此HOTAIR-miR-326-FGF1轴可能是恶性脑胶质瘤发生的机制，这一研究成果为胶质瘤临床治疗提供了一个新的策略。

六、展望

恶性脑胶质瘤是迄今恶性程度最高的原发性脑肿瘤，目前胶质瘤的发病机制仍不明确，还有待于进一步探索。LncRNA的发现及其研究为该肿瘤的发病机制的研究带来了新希望,肿瘤相关LncRNA的异常调节及表达量的改变预示着该LncRNA可以作为潜在的生物标志物、治疗靶点以及预后指标。但是LncRNA在该领域的研究才刚刚起步，很多肿瘤相关LncRNA仍未被发现，其机制尚不明确还需要未来的进一步探索。

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1671-2897(2017)16-078-03

深圳市科创委基础研究基金资助项目(JCYJ20140414170821309)

汪翔，硕士研究生，E-mail: doctorwang126@126.com

R 739

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2015-10-27；

2015-11-25)