新疆地方绵羊Cytb基因遗传多样性与起源研究

宁礼群，古丽娜·艾山，马合木提·哈力克

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

新疆地方绵羊Cytb基因遗传多样性与起源研究

宁礼群，古丽娜·艾山，马合木提·哈力克*

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

为探讨新疆绵羊系统进化与起源，本文测定了新疆10个羊品种的Cytb序列，并进行了系统发育学分析。结果表明，这10个地方绵羊共有 37种单倍型，60个多态位点；单倍型多样度为0.785±0.00193，核苷酸多样度为0.00368±0.01185，表明新疆地方绵羊品种的遗传多样性丰富；不论是邻接法(Neighbor Joining)还是最大似然法(Maximum Likelihood)系统进化树都表明新疆地方绵羊共分为3支，说明新疆地方绵羊至少有3个独立的母系起源。本研究为确立新疆地方绵羊种群关系和保护物种资源提供理论依据。

细胞色素b；地方绵羊；遗传多样性；起源

新疆最有特色的基础和传统产业是畜牧业，新疆的畜牧业发展潜力巨大。新疆主要畜种一直是绵羊，改革开放以来，的效益得到显著提高，规模也不断扩大，目前养羊产业已成为新疆畜牧业的主导产业[1-2]。目前，新疆主要畜禽品种共有59种，其中绵、山羊23种，牛7种，马、驴羊产业、驼7种，猪9个，家禽7种，特种经济动物2种[3]。新疆地方绵羊品种共有9种、育成品种4种、引进品种4种[4]。

畜禽遗传资源，与人类关系最密切、最直接，畜禽遗传资源也受人类影响最大的一部分。它是人类生活重要的生产资料，与人类社会生活有着非常密切的关系，如果要和野生物种多样性丢失相比，它的丢失对人类利益的损害更大。研究动物的mtDNA，可以更深入的了解家畜的驯化过程，确定其野生近缘种，也可以推测驯化起源地、时间及规模，理解家畜的分化和品种内变化[5]。mtDNA已被用于解决家畜遗传多样性、系统进化关系、起源分化的关系、遗传亲缘关系[6-10]等方面的研究，保护生物学家越来越重视家畜品种遗传资源，对于制定保护策略有巨大的贡献。

关于新疆家绵羊的起源目前不是很清楚，许多野生品种如摩佛伦羊(Ovisorientalis)、盘羊(Ovisammon)、塬羊(Ovisvignei)都曾经被认为是家养绵羊的祖先，或者至少对某些品种遗传资源具有一定的贡献。最近对家养绵羊mtDNA分析显示其有多个不同的母系起源，而且认为在绵羊的进化过程中塬羊和盘羊没有贡献，而家养绵羊共同的祖先被认为是摩佛伦羊[ 11-14 ]，也有研究认为新疆绵羊群体之间分化程度不高[ 15 ]。

本实验通过研究新疆地方绵羊Cytb基因，确定其遗传背景情况和遗传特征，通过Cytb基因来反映其遗传多样性和丰富度，确定绵羊在种内、种间的遗传结构，了解绵羊各类群间及其近缘群中间的亲缘关系。根据绵羊的遗传分化情况划分绵羊品种类型，同时为遗传资源的动态监测，合理开发利用家畜的遗传资源，定向培育新品种，为进一步摸清新疆地方绵羊品种遗传现状提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验随机采集蒙古羊、哈萨克羊、巴仕拜羊、卡拉库尔羊、柯尔克孜羊、哈密羊、和田羊、麦盖提羊、塔什库尔干羊、阿尔泰羊血样各十份(表1)，共100份。每只羊取静脉血2 mL，无水乙醇与血样按1∶1混匀，置于2 mL冻存离心管中，-20 ℃保存。本实用酚-氯仿法提取血样DNA。于0.8 %琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度，将浓度稀释成50 ng/μl，-20 ℃保存备用。

1.2 PCR扩增与测序

引物的合成根据文献报道[16]，直接确定目前广泛应用的引物序列：上游引物5′ TGATCAACATCCGAAAAACC-3′， 下游引物5′-TTCGATGATGCTAGC TACTGG-3′。该引物由上海生工生物技术公司合成。PCR反应体系为10×Buffer 1.5 mmol/ L、dNTP 0.17 mmol/L、Primer L 0.4 mmol/L、Primer R 0.4 μmol/L、Taq酶 2U、DNA 2 ng/μl，ddH2O补齐50 μl。PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性 5 min，30个循环(95 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃最终延伸10 min，4 ℃保存。1.5 %琼脂糖凝胶检测，由上海生工进行双向测序。

1.3 统计方法与分析软件

测序结果用Chromas观察峰值并用DNAStar7.1对序列进行编辑校正；采用DNAMAN6.0对正反向序列进行拼接；将100条地方绵羊Cytb全序列和NCBI数据库中下载的其他的序列进行比对分析；使用MEGA6.0[17]统计序列碱基组成、多态位点数、单一信息位点数、简约信息位点数、单倍型间的遗传距离等，以邻接法(Neighbor-joining，NJ)和极大似然法(Maximum likelihood，ML)构建系统发育树,进化树各分支的置信度采用1000次自检分析进行重复检验；Medianjioning单倍型网络图由Network4.6.11[18 ]绘制。应用DnaSP 5.10[19 ]计算单倍型数(Number of haplotypes，h)，单倍型多样度(Haplotype diversity，Hd)，核苷酸多样度(Nucleotide diversity，Pi)，平均核苷酸差异数(Average number of nucleotide differences，K)，遗传变异系数Fst，基因流Nm，并进行中性检验，绘制单倍型岐点分布图(Mismatch distribution)。

2 结果与分析

2.1 Cytb基因全序列的碱基组成及序列变异

经测序得到100个样本的扩增序列，经过软件校对和编辑后有效序列全长为984 bp。结果表明PCR扩增总是产生大小相同的条带，无其他非特异性条带影响，经序列比对与氨基酸转换，表明无转化、确实和插入密码子出现。由此可得我们所得到的序列均为线粒体细胞色素b序列，而非细胞核中线粒体假基因的干扰。从100条绵羊Cytb基因序列共定义37种单倍型。T、C、A、G 4种碱基组成的平均含量来看分别为27.4 %、29.1 %、30.1 %和13.4 %，各品种间4种碱基的比例也略有差异，但差异不显著。其中G+C含量的比例为42.5 %，低于A+T含量的比例57.5 %。从结构上说明了Cytb区的功能明显的反G偏倚，是脊椎动物线粒体DNA的共同特点之一 。

表1 新疆地方绵羊遗传多样性参数

图1 Cytb 基因的变异位点Fig.1 Variable sites of Cytb gene

各绵羊群体的核苷酸多样度(Pi)、单倍型多样度(Hd)和平均核苷酸差异数(K)见表1。从单倍型角度来看，巴什拜羊单倍型多样度最高，为1.000±0.0020，而蒙古羊单倍型多样度最低，为0.378±0.0328；核苷酸多样性反映的是核苷酸序列的平均差异，麦盖提羊最高，为0.0061，最低为哈密羊0.001。在所有位点中没有发现插入和缺失变异，共发现60个变异位点，均为两碱基变异，其中单一多态位点32个，简约信息多态位点28个。3个位点发生转换，0个位点发生颠换。图1为地方绵羊Cytb基因37种单倍型的多态位点。

表2 新疆地方绵羊群体间遗传距离

2.2 新疆地方绵羊遗传结构分析分析

本实验所测序的10个绵羊品种100条序列经软件分析，确定了37 种单倍型，其中H1为优势单倍型，约占样本含量的46 %，巴仕拜羊的单倍型数最多10个单倍型多样性也最高1.000±0.00200，其次是塔什库尔干羊表现出7个单倍型，柯尔克孜羊、哈萨克羊表现出6个单倍型，哈密羊和卡拉库尔表出5个单倍型，和田羊和阿勒泰羊表现出4个单倍型，蒙古羊表现出3个单倍型见(表1)。

对10个受试绵羊品种的细胞色素b部分序列，利用MEGA 6.0软件选择Kimura-2参数模型，计算品种间的平均遗传距离。从表2可以看出，和田羊与哈萨克羊的遗传距离最近0.0020，巴什拜羊与麦盖提羊遗传距离最远0.0058。

应用软件NETWORK 4.1.1.1，采用中介网络分析法(Medianjioining)对绵羊群体的Cytb序列进行分析。家养动物在驯化过程中会随着人类的迁移，从起源地不断向外迁移，形成群体扩张，在网络上表现出的是“星状结构”，因此，对于系统发育分析，传统“二叉树”对物种内个体间较近的DNA序列之间的进化反映不真实研究证明通过网络分析。更能客观描述种内不同单倍型间的遗传进化关系。中介网络进化图显示新疆地方绵羊群体可分为A、B、C 3个大的支系，从表2可以看到，每个支系呈“星状”，提示新疆地方绵羊至少存在有3个独立的母系起源。实心圆点(红色圆点)为软件给出的中间单倍型，通过它将其他一些单倍型连接起来，从进化的角度这些中间单倍型可以解释为他们在群体中存在没有检测到，或者在群体中曾经存在但随着进化随机消失了。

依据所获得的细胞色素b序列，选取绵羊近缘种盘羊(Ovisammon)，欧洲摩弗伦羊(Ovismusimon)，东方盘羊(Ovisorientalis)的同原序列(GenBank登录号：AJ867276.1、D84203.1 、FJ936231.1)作为外群，采用Kimura 2-参数模型，同时应用自引导检验(bootstrap test)估计系统树中结点的置信度(自引导的重复次数为1000次) ，采用Neighbor-joining、Maximum likelihood 2种方法，构建2个种群各单元型间的系统发生关系。从图3～4可以看出，3个分支与单倍型一一对应。37个单倍型可以归结为3个独立的分枝，分别命名为A、B和C。其中A单倍型组包括22个单倍型，B单倍型组包括9个单倍型，并发现欧洲摩弗伦羊余B支系聚在一起，C单倍型组包括6个单倍型。这一结果提示现代家绵羊有3个独立的母系起源，其中A和B单倍型已经被证实，而第3种单倍型(C单倍型)为新发现的单倍型。在所有的系统聚类图中，这3个单倍型组都保持了相对的稳定性，而且各单倍型组内的个体也大体一致，从而进一步证实了第3个母系起源的存在。支系B与支系C遗传距离最大为0.0149，A与B最小为0.0051；遗传分化系数Gst支系A与支系C较低0.00277，说明2个支系之间的距离较远(表3～4)。Fu’s检验表明差异不显著(D=-2.21875， 0.05

图2 10个绵羊群体的网络进化分析Fig.2 Network analysis based on mt-DNA haplotypes of 10 sheep populations

LineageABB0.0051-C0.0130.015

图3 基于细胞色素B(Cytb)基因列构建的邻接树Fig.3 NJ tree based on Cytb gene sequence

图5 A支系核苷酸不配对分布Fig.5 Mismatch distribution for lineage A

LineageLineageGstDaDxyFsttestAB0.00680.00180.00510.3584BC0.01500.00630.01110.5629CA0.00280.00810.01300.6236

图4 基于细胞色素B(Cytb)基因列构建的最大自然数Fig.4 ML tree based on Cytb gene sequence

图6 B支系核苷酸不配对分布Fig.6 Mismatch distribution for lineage B

图7 C支系核苷酸不配对分布Fig.7 Mismatch distribution for lineage C

2.3 新疆地方绵羊群体历史动态分析

对分析的绵羊细胞色素b 序列用Tajiam’sD值进行中性检验，个绵羊品种的Tajiam’sD值详见表1，各绵羊品种经中性检验均不显著，而整个绵羊群体Tajiam’sD值为-1.9678，经中性检验也不显著(P>0.10)，符合中性突变。根据群体核苷酸不配对分布曲线是否呈现多峰或单峰型，以及Tajiam’s D值中性检验是否显著判定群体在过去是否发生了群体扩张，若核苷酸不配对曲线呈现单峰分布，且Tajiam’sD值显著偏离中性检验，则群体在过去经受了扩张，反之群体大小保持稳定[20-21]。本实验测定3个支系的核苷酸不配对分布曲线如图5～7所示，分析表明A支系呈现单峰Tajiam’sD值中性检验结果显著说明A支系过去出现群体扩张，B支系呈现双峰Tajiam’sD值中性检验结果不显著说明B支系过去没有出现群体扩张和持续增长模式，群体大小保持稳定。C支系呈现多峰Tajiam’sD值中性检验结果不显著说明群体可能经历过多种瓶颈效应，也可能群体水平保持不变。

3 讨 论

3.1 新疆地方绵羊Cytb序列特征和遗传多样性

在984 bp的所有序列中共检测出60个变异位点，其中单一多态位点32，简约信息多态位点为28个。远远低于D-loop区的核苷酸多样性，可见Cytb基因具有相对的保守性。本研究测定了新疆地方绵羊100只个体的Cytb序列，共检测出37个单倍型，单倍型的多样性为0.785±0.00193，核苷酸多样性为0.00368±0.01185，说明新疆地方绵羊群体具有较高的遗传多样性。张传生等[22]利用细胞色素b基因的部分序列片段对4个绵羊品种进行了研究，结果mtDNA多态性较贫乏，G+C的平均含量为38.3 %，核苷酸替换在绵羊上全部为转换。国内学者通过mtDNA的RFLP方法对我国其他绵羊品种(云南的3个绵羊品种[23]，蒙古羊、乌珠穆沁羊、湖羊和小尾寒羊[24]贵州威宁绵羊和六盘水绵羊[25])的研究结果均表明，我国绵羊品种的遗传多样性比较匮乏。另外，贾斌等[26]对新疆8个绵羊品种的遗传多样性和系统发生关系进行了微卫星分析，结果所有绵羊群体的平均多态信息含量均低于国外其他品种的绵羊，基因多态性和遗传多态性相对贫乏。赵倩君等[27]对12个绵羊品种和多角绵羊的细胞色素b全序列，对不同地区、不同类型的中国绵羊群体cytb基因本试验的绵羊个体可定义为 40 个单倍型，单倍型多样度为 0.997±0.006，核苷酸多样度为 0.793 %，反映群体多样性和遗传变异丰富度。结果都说明中国绵羊品种不论从核DNA角度还是从线粒体DNA的角度进行的研究，都表现出遗传多样性较匮乏。耿立英等[28]用PCR方法扩增出滩羊和洼地绵羊共112个个体Cytb基因，用限制性内切酶EcoR Ι对其进行限制性长度多态性(RFLP)分析，结果显示在56个滩羊样品为2种限制性态型，而56个洼地绵羊为1种限制性态型，说明绵羊品种线粒体DNA多态性较第，且mtDNACytb基因在种内、种间保守性较强。

3.2 新疆地方绵羊的起源进化

我国饲养家养动物历史悠久，我国具有家养动物资源非常丰富。据近年来有关报道，我国的绵品种共有79个，山羊品种48个[29]，新疆主要绵羊地方品种9个，育成品种4个，引进品种4个[3]。新疆地大物博，畜牧业历史悠久，其自然条件得天独厚，具有独特的文化条件和社会经济条件，因此新疆地方绵羊品种丰富多样且性状优良。以往关于新疆地方绵羊品种间遗传变异与起源分化研究主要集中在少数品种或群体间，而关于新疆绵羊品种间系统全面的研究却鲜有报道。因此对新疆地方绵羊起源仍存在一定争议。王昕等[30]对中国中西部9个地方绵羊品种Cytb基因全序列进行了遗传多样性与系统进化研究结果表明检测出18种单倍型，单倍型多样性为97.1 %。分析发现现中国绵羊群体存在A、B、C 3种单倍型。曹丽荣等[31]从细胞色素b基因全序列差异分析了岩羊和矮岩羊的系统进化关系，推测矮岩羊与岩羊之间的差异可能已经达到了亚种的水平。张传生等[32]测定了小尾寒羊、大尾寒羊和洼地绵羊mtDNA细胞色素b基因的415 bp基因片段，推测这3个品种具有共同的母系祖先。巩元芳等[33]应用 PCR-RFL P 方法 ，对我国 9 个地方绵羊品种和 3 个引入品种共计 120 个绵羊个体的Cytb基因进行分析，共得到4 种基因单倍型类型，其中单倍型 Ⅰ为受试绵羊品种的基本单倍型。赵倩君等[27]测定中国8个省区 42个绵羊个体的细胞色素 b 基因全序列，试验结果表明共发现 40 个单倍型，单倍型多样度为 0.997±0.006，核苷酸多样度为 0.793 %。系统发育分析表明，中国地方绵羊群体共可分为 4 个支系(A、B、C 和 D)，说明中国绵羊有多个母系起源或经过多次驯化，且未发现盘羊、东方盘羊和亚洲摩佛伦羊对绵羊进化具有贡献的分子证据。

本研究为了进一步确定新疆地方绵羊品种母系起源到底有几个，选择了mtDNA结构中Cytb基因的部分序列进行遗传结构分析。并且我们所选取的样本是新疆各地具有代表的绵羊品种，他们都是长期长期在当地自然地理环境下成长的品种，所受到受外来品种的影响较小甚至没有，因此能够真实反应新疆地方品种的遗传结构和起源。利用细胞色素b基部分全序列构建的系统进化树都表明新疆地方绵羊品种具有3个母系起源，而且第3种单倍型仅在新疆地方绵羊品种中出现，推测新疆可能是现代家绵羊的一个起源地，这一结果与Hiendleder[34-37]等的观点不同。样本来源不同是导致这一差异的主要原因是，他们所研究的样本是来自于非洲、新西兰、欧洲和中亚地区，并没有新疆地方绵羊品种。在本试验中通过借用GenBank上已发表的欧洲摩弗伦羊，东方盘羊，亚洲摩弗伦羊的细胞色素b部分序列构建的系统树。结果表明，摩佛伦羊聚在B单倍型组中，说明与新疆地方绵羊品种关系较近的是摩佛伦羊。而盘羊自成一类，并没有出现在3个单倍型组中，3个支系之间的遗传距离表明支系A与支系B之间的遗传距离较近，C支系与其他2个支系之间的距离较远，证明了Hiendleder等的观点。在C单倍型组中也没有出现欧洲个体，因而可以进一步论证上述结果的可靠性，即新疆地方绵羊品种间存在第3个母系起源，而且起源地可能就在中国。此外，由于序列数据本身的局限性问题，还要通过表型分析、考古学、社会学以及历史学等方面提供佐证。

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(责任编辑 陈 虹)

Genetic Diversity and Origin of Xinjiang Domestic Sheep(Ovisaries) Analyzed byCytbgene

NING Li-qun, GULNAR Hasan, MAHMUT Halik*

(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Xinjiang Urumqi 830016, China)

In order to explore the Xinjiang sheep’s system evolution and origin, thecytbsequences from 10 breed populations were studied. The result showed that the 37 different haplotyes and 60 polymorphic sites from 10 breed populations by phylogenetic analysis were found; The haplotype diversity(Hd), nucleotide diversity(Pi) of them were 0.785±0.00193, 0.00368±0.01185, which indicated that Xinjiang sheep breed populations had high genetic diversity; The phylogenetic trees by Neighbor joining or Maximum likelihood were divided into three branches,which would provide a theoretical basis for the establishment of the domesticated sheep population relation in Xinjiang and the protect of germplasm resource.

Cytb; Domestic sheep; Genetic diversity; Origin

1001-4829(2016)12-3001-08

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.041

2015-11-08

国家自然科学基金项目(31360266)

宁礼群(1991-)，女，硕士研究生，主要从事动物保护遗传，E-mail:379960499@qq.com，*为通讯作者：马合木提·哈力克(1959-)，维吾尔族，男，教授，博士，博士生导师，E-mail: mahmuthalic@xju.edu.cn。

S826

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