三脉紫菀有效组分配比的平喘作用及其毒性研究

康林之，朱建成，任 刚，罗 云，张 婧，刘荣华，杨 明，王 芳，何小汝，赵海平△

(江西中医药大学:1.护理学院;2.药学院;3.现代中药制剂教育部重点实验室，南昌 330004)

三脉紫菀有效组分配比的平喘作用及其毒性研究

目的 研究三脉紫菀抗慢支组分平喘作用的最佳配比及其毒性。方法 合格豚鼠72只，体质量(300±20)g，雄性，分为空白组、氨茶碱组(0.047 g/kg)、三脉紫菀总皂苷与总黄酮不同配比组(8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8，0.38 g/kg)。各组连续灌胃给药3 d，每天1次，采用His-Ach雾化引喘法通过诱咳引喘仪优选最佳配比；制备豚鼠离体气管环标本，采用Powerlab生物信号采集系统，考察豚鼠平滑肌条在正常克氏液条件下加入氯化乙酰胆碱(Ach)后的收缩变化，以及其他组分别在Ach致平滑肌收缩最明显时，加入氨茶碱(1.25 mg/mL)后的平滑肌舒张百分率。采用经典的小鼠急性毒性实验方法，考察三脉紫菀总皂苷、总黄酮及其1∶2配比的急性毒性。结果 较之空白组，氨茶碱组、其他各给药组的致喘潜伏期延长显著(P<0.05)，其中1∶1、1∶2、1∶4组与其他配比组均有显著差异(P<0.05)，但又以1∶2组引喘潜伏期最长。氨茶碱组与各配比组均能明显松弛Ach导致收缩的豚鼠气管平滑肌，其中氨茶碱组舒张百分率最大(24.12±1.20)%，各配比组舒张百分率不及氨茶碱组(P<0.05)，但以1∶2组与之最接近。三脉紫菀总皂苷、总黄酮及其1∶2配比对小鼠的最大耐受量分别为300、345、325 g/kg。结论 在给药总量恒定的情况下，三脉紫菀总皂苷与总黄酮1∶2平喘解痉作用明显，其总黄酮、总皂苷及1∶2配比的急性毒性实验未显示明显的毒性作用，安全性相对良好。

三脉紫菀；皂苷类；黄酮类；平喘；急性毒性

一味中药就是由其自身有效组分构成的“小复方”，其临床效应是“复方”体系对病变黑箱(患者)产生的总体效应，而组分构成比例变化是药物总体效应强弱的关键。三脉紫菀(Aster ageratoides Turcz．)为菊科(Compositae)紫菀属植物的干燥全草或根。曾在1971年被定为全国18种防治慢性气管炎有效药物之一[1-6]。据报道其地上部分主含黄酮苷，根部主含皂苷，此外还含有萜类、甾类等成分。其中黄酮类成分、皂苷类成分是其抗慢支的主要药效物质基础[7-8]。本课题组前期从祛痰止咳角度开展了其有效组分的最佳配比研究[9]，基于此，本研究拟进一步采用豚鼠探讨三脉紫菀有效组分平喘的最佳配比，并初步考察其相应的安全性，以期为其抗慢支机制及创制新药制提供有力支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 实验用三脉紫菀采集于南昌市近郊，经江西中医药大学中药资源与民族药研究中心鉴定为三脉紫菀。

1.1.2 试剂 氨茶碱片(太原市振兴制药有限责任公司，批号20111206)；氯化乙酰胆碱(Ach)与磷酸组胺(His,上海楷洋生物技术有限公司，批号2012116与2012116)。改良Krebs液[10]：NaCl 7.5 g，CaCl20.24 g，MgCl20.05 g，KCl 0.35 g，NaHCO31.15 g，NaH2PO40.1 g，葡萄糖1.0 g配于1 000 mL蒸馏水。实验前用5% O2和CO2混合气体饱和。其他试剂均为化学纯。

1.1.3 仪器 YLS-8A多功能诱咳引喘仪(济南益延科技发展有限公司)；AUTOMATIC ORGAN BATH(Panlab)；Powerlab生物系号采集系统(ML141 sptrometer，ML132 Bto Amp)。

1.1.4 动物 KM种小鼠[清洁级，江西中医药大学动物中心，SCXK(赣)，2011-0001]；豚鼠[普通级，上海生旺实验动物养殖有限公司，SCXK(沪)，2012-0007]。

1.2 方法

1.2.1 药品制备 参照前期三脉紫菀制备工艺[7,11-12]。总皂苷部位制备：取根部500 g，经70%、95%乙醇浸提，大孔吸附树脂处理滤液，浓缩干燥，得浸膏3.99%。总黄酮部位制备：取茎叶500 g，经70%、95%乙醇浸提，大孔吸附树脂处理滤液，浓缩干燥，得浸膏1.477%。保存备用。

1.2.2 剂量设定 参照前期剂量设计方法[13-14]，确定总皂苷、总黄酮部位的总量，参照药典及其他文献等资料设定两类成分的配比。其中，按一定梯度一类成分递减的同时，另一类成分递增，反之亦然。配比如下(质量比)：总皂苷与总黄酮以8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8。

1.2.3 平喘实验研究

1.2.3.1 豚鼠筛选实验 72只雄性豚鼠体，质量(300±20)g，接通多功能诱咳引喘仪后，分别对每只豚鼠进行筛选，将配制好的引喘液(2.0×10-2g/mL Ach和1.0×10-3g/mL His等体积混合液)喷入仪器7 s，每只豚鼠的引喘潜伏期一般小于150 s，如大于150 s者，不予选用组内。豚鼠因吸入引喘液出现痉挛抽搐，立刻打开仪器取出，必要时人工辅助呼吸，避免窒息死亡[15]。

1.2.3.2 对豚鼠的平喘实验 将筛选出的72只豚鼠分为9组，每组8只。灌胃给药，每只0.2 mL/10 g，每天1次，共3 d。氨茶碱组豚鼠灌胃氨茶碱0.047 g/kg，空白组豚鼠灌胃等量的生理盐水，各给药组按设定剂量给药。第3次给药1 h后，将豚鼠放入仪器内，喷7 s引喘液，观察记录其出现哮喘性痉挛抽搐的潜伏期(即引喘潜伏期)。如2 min内未出现喘息，视其潜伏期为120 s[15]。

1.2.4 对豚鼠离体气管平滑肌的舒张实验 用木棒击豚鼠后脑致昏后，在颈部腹面正中切开皮肤及皮下组织，分离气管，剪下甲状软骨下至气管分叉处的部分，长约20 mm，制备平滑肌环，固定于离体气管仪器内，基值调整3 g，置换Kerb液1次/20 min，稳定约1 h，曲线稳定后，对9个组别分别开始实验。对Ach组，于气管条平衡稳定后，加入5×10-4g/mL Ach 0.4 mL，并记录数据。其他8组分别于Ach致收缩曲线上升至最明显时，加入氨茶碱(1.25×10-3g/mL)及各组的配比药液(0.02 g/mL)0.4 mL。观察并记录实验数据，计算舒张百分率。舒张百分率=(给药前曲线最大值-给药后曲线最小值)/ 给药前曲线最大值×100%[10,15]。

1.2.5 急性毒性实验研究

1.2.5.1 预实验 健康KM小鼠36只，体质量(20±2)g，雌雄各半，分成9组，每组4只。即总皂苷高、中、低组，总黄酮高、中、低组，总皂苷与总黄酮1∶2配比高、中、低组，实验前12 h禁食不禁水。将总皂苷、总黄酮及其1∶2配比分别配制成最大浓度(0.75、0.86、0.81 g/mL)，且等比(1∶0.85)稀释，得到其他剂量。各组按最大体积0.4 mL/10 g容量，一次性灌胃，连续观察7 d，记录期间小鼠死亡数和一般情况[16-17]。结果表明，各组小鼠精神与活动状态良好，无死亡。提示各组药物的急性毒性较小，无法测得其半数致死量(LD50)，故改为测定各组药物的小鼠最大耐受量(Maximum tolerated dose，MTD) 。

1.2.5.2 MTD实验 健康KM小鼠80只，雌雄各半，体质量(20±2)g，分为4组，每组20只，即：空白组、总皂苷组(0.75 g/mL)、总黄酮(0.86 g/mL)、总皂苷与总黄酮1∶2配比组(0.81 g/mL)，实验前12 h禁食不禁水。各组给药1次，0.4 mL/10 g，空白组给予等体积蒸馏水。给药后连续观察14 d[10,16-17]，期间详细观察记录实验动物每天的反应及体质量变化、摄食量变化、中毒反应及死亡情况等。观察期结束后，处死小鼠进行尸体解剖检查。

2 结 果

2.1 豚鼠的平喘实验 与空白组比较，氨茶碱组与其他各给药组的引喘潜伏期延长显著(P<0.05)；其中1∶1、1∶2、1∶4组与其他配比组均有显著差异(P<0.05)，但又以1∶2组引喘潜伏期最长。见表1。

表1 各组对豚鼠的平喘作用

*:P<0.05,#:P<0.01,与空白组比较;△:P<0.05，与其他各给药比较；-：此项无数据。

2.2 豚鼠离体气管平滑肌舒张作用的实验 氨茶碱组与各配比组均能明显松弛Ach导致收缩的平滑肌。其中，氨茶碱组舒张百分率最大，各配比组舒张百分率不及氨茶碱组(P<0.05)，但尤以1∶2组作用明显。见表2。

2.3 急性毒性实验 本实验结果显示，总皂苷、总黄酮及其1∶2配比对小鼠单次灌胃给药的MTD分别为300、345、325g/kg。观察期间，各给药组灌胃后2h内个别动物出现自主活动减少、反应迟钝，其余未见异常现象；给药后第2天起，所有动物饮食正常，精神状态良好，皮毛光泽、活动灵活积极，体质量正常增长；继续观察14d后无动物死亡。处死并解剖各组小鼠，未见心、肝、脾、肺、肾等主要脏器出现异常。

表2 各组对豚鼠离体气管平滑肌的影响

*：P<0.05，#：P<0.01，与氨茶碱组比较。

3 讨 论

中药有效组分配伍是目前中药配伍的新兴模式之一，而厘清各有效组分配伍间的协同、拮抗等机制，则是优选科学配比的关键一环[1-6]。毒性研究是反映药物对机体安全性的初始资料[17]，在其综合的安全性评价体系中具有极其重要的地位和作用。

本研究数据显示，在确定三脉紫菀总皂苷、总黄酮部位总量的情况下，各配比组可使豚鼠的引喘潜伏期延长显著(P<0.05)，且平喘作用随总黄酮比例增加而增强，1∶1、1∶2、1∶4组与其他配比组差异显著(P<0.05)，但又以1∶2组引喘潜伏期最长。表明各配比组的平喘作用与总皂苷和总黄酮的配比密切相关，且存有协同增效的可能。豚鼠气管平滑肌分布的受体主要有H1、M和β2等，其中兴奋H1、M受体可发生收缩，兴奋β2受体可发生舒张。Ach致气管平滑肌收缩模型，是由Ach作用于M受体，使钙通道(ROC)和VDC开启，发生钙内流，并水解细胞膜上磷酸肌醇，生成二酯基甘油(DAG)与肌醇三磷酸(IP3)，使内钙释放，气管平滑肌收缩[18-19]。研究结果显示氨茶碱组与各配比组均能明显松弛Ach导致收缩的平滑肌，氨茶碱组舒张百分率最大(24.12±1.20)%，其中虽各配比组不及氨茶碱组(P<0.05)，但尤以1∶2组舒张作用明显，而抑制Ca2+内流可能是其主要机制。三脉紫菀总皂苷、总黄酮及其1∶2配比的急性毒性实验结果显示，各组药物对小鼠单次灌胃给药的MTD分别为300、345、325g/kg(分别相当于成人用量25、28.75、27.08g/kg)，各组动物活动饮食正常，观察结束后无死亡，主要脏器肉眼观亦未见异常。提示各组药物对小鼠几乎无急性毒性损害。

目前，国内外均有文献报道[20-21]，黄酮及皂苷类物质具有多种生物活性及药理作用。三脉紫菀作为抗慢支的有效药物之一，加强其有效组分配比的优化研究，可为今后的开发利用提供数据支撑。然而，也有报道称[22-23]，诸如沙青子总黄酮、盾叶薯蓣皂苷及七叶皂苷等组分对实验动物有毒性作用。可见，对于不同来源的黄酮或皂苷类物质，其安全性不能一概而论。所以，今后也有待于结合组分间相互作用、体内转化代谢及长毒观察等方面深入探讨。

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Study on the effective compositions of Aster ageratoides Turcz for relieving asthma and its toxicity*

KangLinzhi1,Zhujiancheng2,RenGang3,LuoYun3,ZhangJing3,LiuRonghua2,YangMing3,WangFang2,HeXiaoru3,ZhaoHaiping2△

(1.SchoolofNursing;2.CollegeofPharmacy;3.KeyLaboratoryofModernPreparationofTCM,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang，Jiangxi330004,China)

Objective To study the effective composition of Aster ageratoides Turcz for relieving asthma and its toxicity.Methods Seventy-two qualified male guinea pigs,body mass(300±20)g,were randomly divided into the control group,aminophylline group(0.047 g/kg) and different ratio group of total saponins and total flavonoids(8∶1,4∶1,2∶1,1∶1,1∶2,1∶4,1∶8).Every group received at dose of 0.38 g/kg once a day for 3 days by intragastric administration.The effect of relieving asthma was taken as the indicators for the optimization of compositions,which was detected by observing the latent period of asthma induced by acetylcholine-histamine in guinea rats.The relaxation percentage of smooth muscle retracted by acetylcholine was detected by Powerlab biological signal collecting system when aminophylline(1.25 mg/mL) and different matching drugs(0.02 g/mL) were added in Krebs′ solution.The acute toxicities of total saponins,total flavonoids and mixture of total saponins with total flavonoids(ratio of 1∶2) were detected by classical acute toxicity test of mice.Results Compared with the control group,aminophylline group,each group latent period of inducing asthma significantly or very significantly prolonged (P<0.05),among them,1∶1,1∶2,1∶4 group and other matching group were significantly different(P<0.05),but 1∶2 group cited the longest incubation period.Aminophylline group and the ratio could significantly relaxe guinea pig tracheal smooth muscle retracted by acetylcholine.Aminophylline group diastolic percentage was the largest(24.12±1.20)%,all the groups were less than the percentage of diastolic aminophylline group(P<0.05),but in 1∶2 group with the closest.Aster ageratoides Turcz,tatarian aster total saponins,total flavonoids and the ratio of 1∶2 to mice maximum tolerance was respectively 300,345,325 g/kg.Conclusion For the same total dosage,the relieving asthma effects of proportions of 1∶2 Aster ageratoides Turcz were obvious.There are no abnormal changes in the acute toxicity trila with total flavonoids,total saponins，as well as the ratio of 1∶2,safety is relatively good.

Aster ageratoides Turcz;saponins;flavone;antiasthma；acute toxicity

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.005

十一五重大新药创制资助项目(2009ZX09310-005);江西省科技厅资助项目(20111BBG70005-4);江西中医药大学校基金资助项目(Y027)。 作者简介：康林之(1979-)，讲师,硕士，主要从事中西医结合的临床研究。△

康林之1，朱建成2，任 刚3，罗 云3，张 婧3，刘荣华2，杨 明3，王 芳2，何小汝3，赵海平2△

(江西中医药大学:1.护理学院;2.药学院;3.现代中药制剂教育部重点实验室，南昌 330004)

TQ461

A

1671-8348(2016)36-5056-03

2016-07-18

2016-09-26)