酵母菌富集有机硒和有机锗的条件筛选

■韩东魁 高 凯 张 敏* 陈石婷 国传福

（1.延边大学，吉林延吉133000；2.珲春市龙裕农业发展集团有限公司，吉林珲春133300）

1886年，锗元素被德国化学家发现。一百多年来，科研工作者对锗元素进行了大量探索性的研究，合成的主要化合物类有锗的氧化物、硫化物、卤代物等，为锗在医药、食品、工业等方面的广泛应用奠定了基础[1]。锗有两种存在形式即有机锗和无机锗。无机锗被动物和人类摄入之后是有毒的，并且会在体内蓄积，对动物和人体是有害的。有机锗最显著的功能是抗癌作用。有机锗对多种癌细胞都有抑制作用，并且可以增强动物和人类的免疫功能；对于人类而言，有机锗具有美容养颜，延缓衰老，对预防感冒，骨质松软，促进血液循环都有着很好的疗效[2]。

硒元素于1973年被正式列入人体必需微量元素。它与动物体和人体的各种生理机能有着密切的联系。硒元素与锗元素相同，分为有无机硒和有机硒二种。无机硒以氧化态的形式存在，它的毒性高于有机硒，而吸收率和利用率明显低于有机硒。有机硒以Se2-或者结合态形式存在。结合态存在的硒可以在体内存储，当机体缺硒时则通过生理代谢而得到补充。有机硒与多种疾病的发生有着密切的关系，也可以预防糖尿病、心血管病，以及在某种程度上抑制艾滋病的进一步发展[3]。

米糠安全、绿色、价格便宜，并且具有降低胆固醇含量，通便，减少尿结石等诸多营养学作用[4]。本试验以有机米糠作为富硒富锗酵母的发酵底物，不仅可以发挥出有机硒和有机锗的生物学特性，而且发挥了米糠的最大价值。富硒富锗有机米糠作为饲料添加剂，它为动物提供了优质的蛋白质的同时还可以提高饲料的利用率和适口性[5]。在申小云等[6]的硒锗对耗牛抗氧化功能的影响中研究表明，当硒锗同时作为添加剂添加到饲料中的效果明显高于单一元素作用的效果。本试验使酵母菌同时富集2种微量元素，这一酵母“双富”产品开辟了一种新的生物矿物质资源，并在养殖业上具有一定的应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金属耐受性高的酵母菌由本实验室保存；

固体培养基：PDA培养基（含氯霉素）；

液体酵母菌种子合成基；

米糠发酵培养基∶营养液（葡萄糖∶淀粉∶蒸馏水=1∶1∶50）；

有机米糠由吉林省珲春市龙裕农业发展集团有限公司提供。

1.2 仪器

高压灭菌锅、超净工作台、菌体恒温培养箱、恒温干燥箱、紫外可见分光光度计、电子精密天平、电炉子、计数器、分液漏斗、摇床、250 ml锥形瓶（若干）。

1.3 主要试剂

分析纯亚硒酸钠、GeO2纯度99%、硝酸、高氯酸、硫酸、双氧水、甲苯、0.9%NaCl、40%氢氧化钠溶液、5%氢氧化钠溶液、2 mol/l甲酸溶液、0.5%3,3-二氨基联苯胺溶液（现用现配）、5%EDTA-2Na溶液、1 mol/l NaOH溶液、1 mol/l HCl。

1.4 扩大培养液的制作

从实验室保存的高耐受金属菌种中，用接菌环取一环接种在含有5 ml液体酵母菌种子合成培养基的试管中，30℃、培养18 h。取1 ml上述液体于含有100 ml液体酵母菌种子合成培养基的锥形瓶中，并在锥形瓶的瓶口处盖上透气性良好的棉花塞，30℃、200 r/min于摇床中振荡24 h，作为扩大培养液。在米糠发酵培养基中加入Na2SeO3和GeO2作为硒源和锗源，探究不同因素对酵母菌生成有机硒和有机锗水平的影响。

1.5 酵母菌的计数

取发酵培养后的固液混合物1 g（约1 ml）于10 ml试管中，加入9 ml生理盐水。并且依次做10倍梯次稀释，直至生成浓度为10-4g/ml液体，用移液枪吸取50 μl，滴在PDA培养基中，用涂菌棒均匀涂满整个培养皿，置于培养箱中培养，培养结束后准确查出酵母菌个数。

1.6 有机硒、有机锗生产水平的测定

目前，有机微量元素的测定方法主要通过微量元素的总量与无机微量元素含量的差值求出[7]。本试验通过分光光度法来间接测得有机硒和有机锗的含量。

1.6.1 有机硒含量的测定

发酵试验完成后，从培养箱中取出锥形瓶，将其放在无菌操作台上，用去离子水反复洗涤锥形中的沉淀，将滤液置于105℃烘箱中烘干12 h，所得沉淀物反复研磨成粉末状，即为酵母干粉，并且准确记录所得酵母干粉的重量。

总硒的测定：取上述所得酵母干粉0.2 g置于烧杯中，加入10 ml消化液（高氯酸∶浓硫酸∶双氧水=2∶2∶1），加热至其由浅黄色到透明状为止，待其冷却后，用甲酸和NaOH调节其pH值至强酸性，移至50 ml容量瓶中，定容，放置待测。

无机硒的测定：取上述所得酵母干粉0.5 g置于烧杯中，加入蒸馏水25 ml，小火微沸。待其充分溶解后，反复抽滤烧杯中液体，移至50 ml容量瓶中，定容，放置待测。

样品的测定：分别将上述处理的样品分别取10 ml至于分液漏斗中，用甲酸调节其至强酸性，加入5 ml 0.2%的EDTA-2Na防止其他离子的干扰，再加入10 ml甲苯萃取分层，将所得混合物摇匀，于避光条件下静置3 h至分层。将所得有机层用脱脂棉过滤至比色皿中，在波长为420 mm下，使用分光光度计测定其吸光度，代入标准曲线，即可得总硒含量和无机硒含量，二者差值即为有机硒含量[8]。

1.6.2 有机锗含量的测定

总锗的测定：取上述所得酵母干粉0.2 g于坩埚中，加入5 ml浓硫酸，在通风橱内碳化至无烟为止，碳化完成后小心加入足量的H2O2，将其小火煮至呈透明状，加入10 ml NaOH溶液，加热充分溶解上述溶液，再用1 mol/l的硫酸调节pH值至微酸性，此时溶液为透明状，将所得溶液，移至50 ml容量瓶中，定容，放置待测。

无机锗的测定：取上述所得酵母干粉0.5 g置于烧杯中，加入蒸馏水25 ml，小火微沸。待其充分溶解后，反复抽滤烧杯中液体，定容与50 ml容量瓶中待测。

样品的测定：分别移取上述液体置于比色皿中在，505 mm波长下采用苯芴酮分光光度法测定吸光值，代入标准曲线，可得其总锗和无机锗含量，差值为有机锗含量[9]。

有机微量元素生产水平（mg/l）=酵母菌体有机微量元素含量（mg/g）×发酵米糠酵母菌生物量（g/l）。

2 影响酵母菌生产有机硒和有机锗的因素

2.1 酵母菌的培养时间对富硒、富锗酵母含量的影响

不同的培养时间对酵母菌的生长有着不同的影响。本试验分为6个不同培养时间梯度，每个组中做3个平行处理，培养时间依次为24、36、48、60、70 h以及80 h。其它条件各组均为：温度30.4℃、装液量60 ml、米糠添加量32 g、接种量8%。控制单一变量，分析不同的酵母菌培养时间对其含量的影响，从而优化其培养条件。

2.2 不同的酵母菌的接种量对富硒、富锗酵母含量的影响

本试验设置6个不同酵母菌的接种量梯度，每组做3个平行处理，接种量依次为：7%、8%、9%、10%、11%、12%。其它试验条件为：培养时间60 h、温度30.4℃、装液量60 ml、米糠添加量32 g。控制单一变量，分析不同的酵母菌接种量对富硒、富锗含量的影响，从而得到最适酵母菌接种量。

2.3 不同培养温度对富硒、富锗酵母含量的影响

温度影响着微生物的新陈代谢以及很多重要的生化反应，这对微生物的发酵以及酵母菌对硒和锗的富集能力起着重要的作用。本试验更深一步探究温度对富硒富锗酵母的影响，设置6个不同酵母菌温度梯度，依次为：29.6、29.8、30.0、30.2、30.4、30.6℃。其它试验条件为：培养时间60 h，接种量10%，装液量60 ml，米糠添加量32 g。控制单一温度变量，分析不同培养温度对富硒富锗酵母菌含量的影响。

2.4 不同米糠添加量对富硒、富锗酵母含量的影响

本试验设置6个不同米糠的添加量的梯度，每组做3个平行处理，米糠添加量依次为：24、28、32、36、40、44 g。其它试验条件为：培养时间60 h，接种量10%，温度30.2℃，装液量60 ml。控制单一米糠添加量为变量，分析不同米糠添加量对富硒富锗酵母菌含量的影响，从而确定本试验最佳米糠添加量。

2.5 不同装液量对富硒、富锗酵母含量的影响

装液量的多少直接与发酵提供的营养物质有关。本试验设置6个不同梯度的装液量，每组3个平行处理，装液量依次为：60、65、70、75、80、85 ml。其它试验条件为：培养时间60 h，接种量10%，温度30.2℃，米糠添加量为36 g。控制单一装液量变量，分析不同装液量对富硒富锗酵母含量的影响。

2.6 不同浓度Na2SeO3对富硒、富锗酵母含量及生产水平的影响

本试验设置6个不同Na2SeO3含量的添加梯度，依次为：6、8、10、12、14、16 mg/l。其它试验条件均为：培养时间60 h、接种量10%、温度30.2℃、米糠添加量为36 g、装液量 80 ml/250 mg、GeO2添加量 100 mg/l。探究不同浓度Na2SeO3对富硒、富锗酵母含量及有机硒生产水平的影响。

2.7 不同浓度GeO2对富硒、富锗酵母含量及生产水平的影响

本试验设置6个不同GeO2含量的添加梯度，依次为：60、80、100、120、140、160 mg/l。其它试验条件均为：培养时间60 h、接种量10%、温度30.2℃、米糠添加量为 36 g、装液量 80 ml/250 mg、Na2SeO3添加量10 mg/l。探究不同浓度GeO2对富硒锗酵母含量及有机锗生产水平的影响。

3 实验结果及分析

3.1 酵母菌的培养时间对富硒、富锗酵母含量的影响

从图1中可以看出，培养时间在60 h之前，酵母菌的含量逐渐升高，在60 h出现最大值为4.65×105个。随着培养时间的增加，酵母菌生长呈下降趋势，可能是酵母菌的自溶现象、营养物质不足以及酵母菌的生长曲线有关。综上可见，富硒、富锗酵母菌的最佳培养时间为60 h。

图1 培养时间对富硒、富锗酵母含量的影响

3.2 不同的酵母菌的接种量对富硒、富锗酵母含量的影响

图2 不同接种量对富硒、富锗酵母菌含量的影响

由图2可知，当酵母菌的接种量在7%～10%时，富硒、富锗酵母菌的含量与接种量呈正相关。当接种量为10%，出现最大值为3.43×105个。在此之后，随着酵母菌接种量的增大，富硒、富锗酵母菌含量呈下降趋势。这可能是因为酵母菌之间互相争夺生存空间以及营养物质所致[10]。因此，酵母菌的接种量为10%时，为富硒、富锗酵母最佳接种量。

3.3 不同培养温度对富硒、富锗酵母含量的影响

不同培养温度对富硒、富锗酵母含量的影响，如图3所示，温度对富硒、富锗酵母菌含量有着较大的影响。在29.6～30.2℃富硒、富锗酵母菌的含量是随着温度的升高而增大的，在30.2℃时，酵母菌含量达最大值，为10.67×105个。但是随着温度高于30.2℃，富硒、富锗酵母菌的含量呈下降趋势，这可能是由于温度过高影响了酵母菌细胞中酶的活性，抑制了酵母菌的代谢，导致含量降低[11]。因此，我们选择30.2℃为最适温度。

图3 不同温度对富硒、富锗酵母菌含量的影响

3.4 不同米糠添加量对富硒、富锗酵母含量的影响

图4 不同米糠添加量对富硒、富锗酵母菌含量的影响

由图4可以看出，当米糠的添加量为24～36 g时，富硒、富锗酵母菌的含量呈上升趋势；这主要可能是因为随着发酵底物的增加，发酵混合物的含水量逐渐趋于饱和状态，增加了酵母菌有氧呼吸的接触面积，促进了酵母菌的生长发育；当米糠添加量为36 g时，富硒、富锗酵母菌含量达顶峰，为7.33×105个；但是，随着米糠的添加量逐渐增加，酵母菌含量呈下降趋势。这可能是由于米糠的含量过多，导致米糠过于干燥，抑制了酵母菌的生长。因此，选择米糠添加量为36 g/250 ml为最适添加量。

3.5 不同装液量对富硒、富锗酵母含量的影响

不同装液量对富硒、富锗酵母含量的影响，如图5所示，当营养液的含量低于80 ml/250 ml时，酵母菌的含量呈上升趋势；在装液量为80 ml时，酵母菌的含量达最大值，为9.47×105个；随着营养液的增加，酵母菌的含量呈明显下降趋势。这可能是由于酵母菌无氧呼吸的比例增加，抑制了酵母的数量。因此，确定最佳装液量为80 ml/250 ml。

图5 不同装液量对富硒、富锗酵母菌含量的影响

3.6 不同Na2SeO3添加量对富硒、富锗酵母含量及有机硒生产水平的影响

图6 不同Na2SeO3添加量对富硒、富锗酵母含量及有机硒生产水平的影响

由图6可以看出，当Na2SeO3添加量在整个添加梯度中，酵母菌的生物量均有下降趋势，这与Na2SeO3的毒性有着密切的关系，导致酵母菌含量减少[12]。但在Na2SeO3添加量在12 mg/l时，有机硒的生产水平呈最大值，为2.27 mg/kg。因此，确定Na2SeO3的添加量为10 mg/l对酵母菌富集Na2SeO3最适宜。

3.7 不同GeO2添加量对富硒、富锗酵母含量及有机锗生产水平的影响

图7 不同GeO2添加量对富硒锗酵母含量及有机锗生产水平的影响

由图7可以看出，随着GeO2添加量逐渐增加，酵母菌的生物量呈下降趋势。当GeO2添加量为120 mg/l时，有机锗的生产水平最高达9.80 mg/kg。随着GeO2添加量继续增加时，有机锗的生产水平有下降的趋势，这可能是因为高浓度的GeO2抑制了酵母细胞的生长，导致有机锗生产水平下降。因此，确定GeO2的添加量为120 mg/l对酵母菌的富集GeO2最适宜。

4 结论

通过本试验可以得出，酵母菌同时富集有机硒和有机锗的最适条件为：培养基初始pH值为7.0、培养时间60 h、接种量10%、温度30.2℃、米糠添加量为 36 g/250 ml、装液量 80 ml/250 ml、GeO2添加量为120 mg/l、Na2SeO3的添加量为 12 mg/l,从而获得有机硒最佳生产水平为2.27 mg/kg，有机锗最佳生产水平为9.80 mg/kg。