液相色谱-串联质谱法检测饲料中硫酸黏杆菌素

■李延山

（辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁沈阳110016）

硫酸黏杆菌素是由多黏芽孢杆菌产生的一组功能相似的多肽类抗生素，主要以硫酸黏杆菌素E1和硫酸黏杆菌素E2为主。硫酸黏杆菌素对革兰氏阴性菌有显著的抑菌作用并且有一定的促生长作用，因此硫酸黏杆菌素在畜牧业中被广泛应用。农业部168号公告明确规定饲料中硫酸黏杆菌素使用范围、添加用量以及休药期。然而随着饲料中抗生素添加带来的细菌耐药性问题、畜产品中抗生素残留等问题逐渐凸显。农业部2428号公告做出修订，自2017年4月30日起，硫酸黏杆菌素不得添加于饲料中用于促生长作用。因此，可靠的饲料中硫酸黏杆菌素检测方法是管控硫酸黏杆菌素滥用的重要保障。

1 研究内容

1.1 确定检测参数

硫酸黏杆菌素是由多黏芽孢杆菌产生的一组功能相似的多肽类抗生素，主要以硫酸黏杆菌素E1和硫酸黏杆菌素E2为主。因此，用硫酸黏杆菌素E1与硫酸黏杆菌素E2总含量来表示硫酸黏杆菌素的含量。

1.2 确定对照品稀释液

用乙腈∶甲酸∶水体积比为20∶0.2∶79.8的混合溶液，将硫酸黏杆菌素储备液稀释为C=50 ng/ml，并上机测定，结果表明硫酸黏杆菌素峰面积稳定不减小。因此将乙腈∶甲酸∶水体积比为20∶0.2∶79.8的混合溶液确定为对照品稀释液。

1.3 考查线性相关性

用20%乙腈甲酸水溶液配置硫酸黏杆菌素E1与E2工作液，硫酸黏杆菌素E1与E2系列浓度分别为25、50、100、200、500、1 000 ng/ml，相同条件下，用串联质谱检测上述曲线各点的峰面积，硫酸黏杆菌素E1的浓度与峰面积的相关系数为0.999 8，硫酸黏杆菌素E2的浓度与峰面积的相关系数为0.999 9。

1.4 净化小柱、洗脱液与净化程序

1.4.1 净化小柱的选择

分别选择HLB、C18、MCX、MAX、PCX五款净化小柱，过柱条件参照现行国标：3 ml甲醇活化，3 ml 0.1%甲酸缓冲液平衡后，取3 ml标准工作液（C=200 ng/ml），3 ml 0.1%甲酸缓冲液淋洗，抽干。3 ml 20%乙腈甲酸水溶液洗脱，20%乙腈甲酸水溶液定容至5 ml。0.22 μm微孔滤膜过滤。考察净化小柱回收率发现：HLB优于C18、MCX、MAX、PCX。因此净化小柱选择HLB。

1.4.2 洗脱液的选择

分别考察乙腈∶甲酸∶水体积比为10∶0.2∶89.8；乙腈∶甲酸∶水体积比为15∶0.2∶84.8；乙腈∶甲酸∶水体积比为20∶0.2∶79.8；乙腈∶甲酸∶水体积比为40∶0.2∶59.8；乙腈∶甲酸∶水体积比为70∶0.2∶29.8；乙腈：甲酸体积比为99.8∶0.2。结果显示：乙腈含量＜20%的洗脱液不能完全洗脱，乙腈含量≥20%的洗脱液虽可完全洗脱；但乙腈含量越高，质谱图中杂峰越多，因此洗脱液确定为乙腈∶甲酸∶水体积比为20∶0.2∶79.8的洗脱液。

1.4.3 净化程序

3 ml甲醇、3 ml 0.1%甲酸水溶液依次平衡HLB小柱，取一定体积的样液上柱，3 ml 0.1%甲酸水溶液淋洗，抽干，3 ml 20%乙腈甲酸水溶液洗脱，并用20%乙腈甲酸水溶液定容至5 ml，过0.22 μm滤膜后上机测定。

1.5 提取液与提取方法

1.5.1 提取液

分别考察2%三氯乙酸+10 ml 4%乙酸铅；4%三氯乙酸+10 ml 4%乙酸铅；19 ml 0.5%甲酸水+1 ml饱和乙酸铅；19 ml 0.5%乙酸+1 ml饱和乙酸铅；19 ml 5%草酸+1 ml饱和乙酸铅；19 ml 10%草酸+1 ml饱和乙酸铅；20 ml 5%草酸；20 ml 10%草酸；20 ml 5%柠檬酸；19 ml 10%柠檬酸+1ml饱和乙酸铅。回收试验结果显示：20 ml 5%草酸为提取液适用性较好。

1.5.2 提取方法

称取2 g（精确到0.000 1 g）试样于50 ml离心管中，准确加入20 ml 5%草酸提取液，涡旋混匀，超声提取15 min，然后于8 000 r/min离心5 min，上清液备用。

1.6 仪器条件的确定

1.6.1 色谱条件的选择

本试验采用实验室常用C18色谱柱，以乙腈、甲醇、水作为流动相进行研究。由于硫酸黏杆菌素中含有氮原子和氧原子，易于接受氢质子，因此质谱检测方式选用正离子模式。经试验比较发现，选用C18色谱柱（柱长100 mm，内径2.1 mm，粒径2.4 μm）、0.2%甲酸水溶液和乙腈作为流动相，得到的色谱峰对称性好，无拖尾现象，待测物与样品中的杂质分离效果理想。

液相色谱条件为：色谱柱为C18柱，柱长100 mm，内径2.1 mm，粒径2.4 μm；流动相：A相为乙腈；B相为0.2%甲酸水溶液,梯度洗脱（见表1）；柱温40℃；进样量20 μl。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.6.2 质谱条件的选择

由于仪器厂家不同，质谱各参数也不一致。本试验采用Waters6890液质联用仪，其参考条件如下：离子源为电喷雾离子源；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应监测；毛细管电压、碰撞能量等参数应优化至最佳灵敏度；定性离子对、定量离子对等参数见表2。

表2 硫酸黏杆菌素的定性、定量离子对及碰撞能量参考值

1.7 样品基质效应对回收率的影响

用20%乙腈甲酸水溶液洗脱并定容样液，样品基质效应明显降低，可忽略不计。

1.8 空白饲料样品加标回收试验(见表3)

空白饲料样品涵盖饲料原料、配合饲料、浓缩饲料与预混料。其中玉米面、豆粕、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料、复合预混料的回收结果在70%～110%；但矿物质预混料回收率为35%左右。回收试验表明，该方法定量检测方面除了矿物质预混料，其他饲料均有较好的适用性。定性方面，适用于所有饲料。

1.9 检出限与定量限。

空白饲料中硫酸黏杆菌素E1、E2添加浓度为50 μg/kg，信噪比＞10，因此定量限确定为50 μg/kg。空白饲料中硫酸黏杆菌素E1、E2添加浓度为15 μg/kg，信噪比＞3，因此检出限确定为15 μg/kg。

2 讨论

①以矿物质预混料为空白基质，做添加回收，回收率在35%左右，可能是矿物质预混料中含有某些离子，这些离子干扰了HLB的平衡，影响了洗脱液的洗脱效果。

②用20%乙腈甲酸水溶液作为对照品稀释液，起到明显的抑制基质效应的结果，样品基质的影响可以忽略。这可能是在串联质谱检测时，乙腈能有效促进硫酸黏杆菌素的电离，抑制样品基质中的离子效应。

表3 硫酸黏杆菌素的添加回收试验统计

③用20%乙腈甲酸水溶液作为对照品稀释液，发现硫酸黏杆菌素工作液在24 h内峰值很稳定，说明20%的乙腈可以有效地阻止硫酸黏杆菌素的降解，提高了硫酸黏杆菌素在溶液中的稳定性。

3 结果(见图1)

图1 硫酸黏杆菌素对照品C=200 ng/ml的质谱图

①硫酸黏杆菌素E1的相关系数为0.999 8，硫酸黏杆菌素E2的相关系数为0.999 9；

② 方法的定量限50 μg/kg，检出限为15 μg/kg；

③相对偏差小于20%；

④ 除矿物质预混料以外，回收率达到70%～110%。该方法定量检测除了矿物质预混料外均适用；该方法定性检测适合所有种类的饲料。