酶解法测定常用饲料原料中淀粉的含量

■ 雷 龙 李 强 冯 志 方 勇 张丹丹 王立伟 任 莹，3 赵胜军，3*

（1.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉430023；2.通辽市科尔沁畜牧工作站，内蒙古通辽028000；3.动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，湖北武汉430023）

淀粉是谷物、籽实和块根块茎饲料中的主要组成成分，也是动物营养中重要的供能营养物质，淀粉是饲料分析和食品检测中需要经常测定的营养指标之一，因此，淀粉的测定方法除了要求测定结果准确外，还需要操作简便和快捷。代立刚等(2013)[1]对测定总淀粉含量的方法进行了分类，介绍了常用方法、标准方法和近几年发展的新方法，对各种方法的原理、优缺点和适用的类型进行了评论，对人们在选择总淀粉含量测定的方法时起到一定的参考作用。常用的方法有比色法、酶解法、酸解法和旋光法等。

J.Holm等(1986)[2]提出的快速分析测定淀粉的方法被认为是最准确、最经典的测定淀粉的方法，在该方法中样品先后经过热稳定性α-淀粉酶(α-amylase)、淀粉葡萄糖苷酶（amyloglucosidase)和葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase)的处理，然后用分光光度计在450 nm下比色测定。该方法具有准确、快速的优点，缺点是三种酶制剂在国内很难同时购得，而且酶制剂规格千差万别，同时由于酶制剂价格昂贵，造成了测定成本会很高，因此限制了该方法的推广应用。张平等(2005)[3]参考Megazyme公司试剂盒提供的方法[Mc⁃cleary等(1997、1994)[4-5]；Englyst等(1988)[6]]，结合国内实际情况，探讨利用酶水解准确、方便、快捷的测定饲料中总淀粉含量，为饲料行业测定总淀粉提供一种参考方法。但是由于该试剂盒价格昂贵而没有得到广泛推广。Isabel（1997）[7]将J.Holm等(1986)[2]采用的酶解法进一步优化后，使淀粉的测定更加简便快捷,并且统一采用Sigma公司生产的标准化酶制剂,使该酶解法得到广泛应用。国标中饲料淀粉含量测定方法——旋光法，使用试剂、仪器较少 ，过程简单，操作简便，但不适用于含有光学活性且不溶于体积分数40%乙醇的淀粉以外的物质，或是富含葡萄糖或含直链淀粉超过40%的产品。酸解法是目前食品工业中测定淀粉的国家标准方法，有研究表明，酸解法只适用于测定淀粉含量较低（不超过40%）的饲料饲料[8]。本试验采用Isabel（1997）[7]提出的酶解法对20余种饲料原料中淀粉含量进行了测定，同时据实验室条件用酸解法测定淀粉含量作为验证。

1 材料和方法

1.1 试验材料

收集常用动物饲料样品20余种，包括能量饲料(玉米、小麦、麸皮、米糠)、蛋白质饲料(豆粕、棉粕、菜粕、葵花籽粕、棕榈仁粕)等，风干，过40目筛，装在广口瓶中备用。

采用《饲料分析及饲料质量检测技术》(杨胜，1993)[9]中的方法测定饲料样品的干物质含量。

1.2 试验步骤

1.2.1 试验方法

酸解法具体方法按照国标GB/T5009.9—2008执行[10]，酶解法参照Isabel(1997)[7]的方法。

1.2.2 试验原理

将淀粉完全分散在强碱溶液中，调节溶液的pH值，将淀粉分解成葡萄糖。再通过使用Tris-葡萄糖氧化酶（Tris-Glucose Oxidase,TGO）试剂测定葡萄糖的释放量。将测定葡萄糖的含量乘以转化因子0.9即得淀粉的含量。

1.2.3 主要试剂及仪器

醋酸钠(国药集团，化学纯)、林联茴香胺(国药集团，化学纯)、葡萄糖标准品(国药集团，分析纯)、苯甲酸(国药集团，化学纯)、淀粉葡萄糖苷酶(Sigma，10115)、曲拉通(Sigma，N50)、葡萄糖氧化酶(Sigma，G7141)、辣根过氧化物酶(Sigma，P8375)、粉碎机、锥形瓶、振荡水浴锅、100 ml容量瓶、涡旋振荡器、200 μl进样器、pH计。

1.2.4 试验步骤

1.2.4.1 标准曲线的制作

① 用无水葡萄糖配制250 μg/ml的葡萄糖标准溶液，分别量取0、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μl葡萄糖标准溶液于10 ml离心管中；

②各试管中分别加入蒸馏水，均调整为200 μl；

③在试管中分别加入TGO（Tris-葡萄糖氧化酶试剂）溶液3 ml，37 ℃水浴60 min。

④取出试管并用冷水冲洗试管终止反应，室温放置15 min，用分光光度计在420 nm波长下用1cm比色杯比色，测定吸光值；

⑤以葡萄糖含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，求出其回归方程：y=ax+b。式中：y——吸光值；

x——葡萄糖的含量（μg）。

1.2.4.2 试验样品的测定

①样品采集

准确称取100 mg混合样品于100 ml的试管内，其中包括四个重复。

②样品水解

在试管中加入少量蒸馏水和 2 mol/l NaOH溶液，涡旋振荡均匀后转移到锥形瓶中，40℃水浴剧烈振荡 60 min。用 2 mol/l的HCl溶液、0.1 mol/l的HCl溶液和0.4 mol/l的醋酸钠缓冲溶液调节试管内溶液pH值至4.75左右。加蒸馏水定容至100 ml，再取10 ml溶液于锥形瓶中，加入活性单位为200 U的淀粉葡萄糖苷酶。将锥形瓶置于恒温振荡器中水浴3 h后，取锥形瓶中10 ml溶液转移到100 ml容量瓶中定容。

③样品测定

取容量瓶中200 μl溶液到试管中，加入3 ml TGO试剂，在37℃水浴60 min。取出试管，用冷水冲洗试管终止反应，室温放置15 min，在420 nm下用蒸馏水调零，1 cm比色杯比色，测定吸光值。参考所作标准曲线，计算葡萄糖含量，淀粉含量为葡萄糖值乘以0.9。

2 结果

酶解法和酸解法测定的22种饲料原料淀粉含量结果见表1。

3 讨论

方勇等（2015）[8]研究了饲料纤维水平对淀粉含量测定方法准确性的影响，结果表明，在有纤维的条件下，酶解法测定淀粉含量比酸解法和蒽酮比色法更准确，同时也表明酶解法更适合测定饲料中淀粉的含量。本文主要介绍了一种利用酶水解测定总淀粉含量的方法，并测定了22种常见饲料原料中总淀粉的含量，同时与国标(酸解法)测定的淀粉数据比较，验证酶解法测定的准确性。

从酶解法试验结果可以看出玉米、小麦、麸皮和米糠等能量饲料中淀粉含量比较高，介于29.25%～72.13%之间，且酶解法测定结果趋向高于酸解法的测定结果，这同蒋雁（2007）[11]研究相同，可能是由于盐酸水解淀粉不完全所致。豆粕、全脂膨化豆粕、菜粕、棉粕和葵花籽粕等蛋白饲料中淀粉含量普遍偏低，介于9.37%～19.73%。国产和进口DDGS中淀粉含量分别为12.88%和15.66%，棕榈粕中淀粉的含量较低。通过与酸解法测定结果比较，表明酶解法测定的饲料原料淀粉含量具参考意义。本文介绍的这种利用酶解法测定总淀粉含量的方法，及测定了22种饲料原料的淀粉值，可以为今后淀粉测定的研究作参考。

表1 常用饲料原料淀粉含量（%）

4 结论

① 相较于国标(酸水解法)，酶解法测定玉米、小麦、麸皮和米糠等能量饲料原料以及菜粕、米糠粕、棉粕等蛋白饲料原料中淀粉含量数据更具参考性；

②本文研究的酶解法对葵花籽粕、国产和进口DDGS中淀粉含量的测定具有一定的参考意义。