氨氮降解菌的分离、筛选及鉴定

■王 伟 李 佳 姜军坡 王世英

（河北农业大学生命科学学院，河北保定071000）

家禽养殖过程中的所产生的排泄物在微生物厌氧发酵作用下会产生大量氨气等有害气体。舍内的氨气达到一定浓度后，可诱使家禽罹患呼吸道疾病[1]，使鸡群抗病能力急剧下降，尤其在冬春季节，出于防寒保温的需要，通风受限，鸡舍内氨气浓度急剧升高，更加影响了鸡群的生产性能和健康水平[2]。吴迪梅等[3]发现，肉鸡7～21日龄氨气浓度超过10 mg/m3，28～42日龄氨气浓度超过15 mg/m3，均会对肉鸡的生产性能产生影响，氨气浓度达到60 mg/m3可造成万只规模肉鸡场年经济损失近10万元。同时，鸡场所产生的大量氨气最终排放到大气中，成为可吸入肺颗粒物（PM2.5）形成的重要原因，在与一些酸性物质反应后形成铵盐气溶胶，导致生态系统富营养化和酸化[4]，加剧了环境污染的程度。如何降低鸡粪中氨气的挥发，国内外已有很多研究报道[5]。利用微生物吸收或抑制粪便中氨气的释放的方法因其安全、环保、高效成为近些年来研究的热点。Kim等[6]分离到一株乳酸杆菌KJ-2008菌株，其能将氨气浓度降低98.5%。甘晓等[7]从鸡场排污口粪污和水族箱水中筛选到的一株假单胞菌属YF1菌株和中华根瘤菌属YS2菌株，将两种菌株以1∶1混合喷洒于鸡粪堆上可使鸡粪中氨气释放量降低75.6%。氨气挥发前在粪便中的主要存在形式是NH4+-N，利用微生物对NH4+-N的转化作用，降低粪便中NH4+-N的浓度，进而降低氨气的散发量。刘志云等[8]从鸡粪中分离得到一株具有良好氨氮降解性能的酵母菌LSA，经鉴定为Candida krusei。该菌在1 105.26 mg/l氨氮浓度的培养液具有高强度的氨氮耐受性，转化率为27.28%。芽孢杆菌益生菌抗逆性强，且可以产丰富的消化酶类、调节肠道菌群，应用广泛。其降解氨氮性能多用于水产养殖[9-10]，在家禽养殖中的应用较少。本研究主要是筛选氨氮降解能力强、抗逆性芽孢菌属细菌菌株，使其以饲料添加剂或直接喷洒的方式应用于家禽生产中，并研究其对鸡粪氨气的抑制作用，为以后的理论研究及实际应用提供参考。

1 材料

1.1 供试样品

健康的鸡肠道内容物及粪便。

1.2 培养基

NA培养基、NB培养基的配制方法具体参见《微生物学实验技术》[11]。加入0.3%胆酸盐的NA培养基。

初筛培养基：葡萄糖 5.0 g、NaCl 1.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、(NH4)2SO42.0 g、NaH2PO40.25 g，蒸馏水1 000 ml，琼脂15～20 g，115℃高压灭菌20 min，pH值7.2～7.4。

复筛培养基：葡萄糖 5.0 g、NaCl 1.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、NaH2PO40.25 g、蒸馏水1 000 ml，氨态氮的最终浓度为200 mg/l，以此计算加入的(NH4)2SO4量。115 ℃高压灭菌20 min，pH值7.2～7.4。

1.3 试验试剂

生理生化试验所用试剂参见《常见细菌系统鉴定手册》[12]。

2 试验方法

2.1 氨氮降解菌的分离和筛选

2.1.1 耐受0.3%胆酸盐菌株的分离

分别取鸡肠道内容物和粪便样品各1.0 g置于9.0 ml无菌水的试管中，经80℃加热处理15 min。混匀后取1.0 ml置于9.0 ml无菌水的试管中进行梯度稀释，分别取 10-3、10-4、10-5、10-6稀释度的稀释液各0.1 ml涂布到含有0.3%的胆酸的NA培养基平板上，37℃培养24 h。挑取生长良好、不同形态的单菌落经纯化后，置于4℃冰箱保存备用。

2.1.2 初筛

将2.1.1获得的菌株采用“十字划线法”接入到氨氮初筛培养基上，37℃恒温培养24 h。挑取生长良好菌株进行复筛。

2.1.3 复筛

将初筛得到的各菌株分别接入到NB培养基中，30℃、180 r/min摇瓶培养24 h。以10%的接种量接种到氨氮初始浓度为200 mg/l的液体复筛培养基中，30℃、180 r/min摇床培养。每隔24 h取样后10 000 r/min离心5 min，采用纳氏比色法分别测定上清液中氨氮的含量，并与未接种菌株的空白培养基作对比，计算氨氮降解率。

式中：c——氨氮含量（mg/l）。

2.2 氨氮降解菌株减少氨释放量的研究

称取100 g新鲜鸡粪加入到250 ml三角瓶中，将筛选所获得的各菌株以10%的接种量接入鸡粪中，以加入无菌水作为对照。另量取20 ml 2%硼酸吸收溶液置于50 ml三角瓶中，并滴入指示剂（以甲基红∶亚甲基红=2∶1为指示剂）用于吸收氨气。将两个三角瓶通过胶管连接，保证整个系统密封性良好。将该装置置于25℃恒温培养箱，96 h后通过盐酸滴定法[13]，评价菌液对鸡粪便的产氨量的影响，每组做2个平行。

2.3 拮抗菌株的种属鉴定

所获优良菌株进行菌落形态、菌体特征及生理生化鉴定。参见东秀珠等《常见细菌系统鉴定手册》[12]。

3 结果

3.1 耐受0.3%胆酸盐菌株的分离和氨氮降解菌的初筛

本试验分离得到15株耐受0.3%胆酸盐菌株。通过初筛得到9株能够在仅含有硫酸铵为营养物质的培养基中生长良好的菌株，分别为N-1、N-2、N-3、N-4、C-1、C-2、C-3、J1和T-1。

3.2 复筛

对初筛所获得的菌株分别在不同时间进行氨氮降解率的测定。结果发现，接入C-2、C-3、T-1和N-3菌液的培养基中氨氮含量随着试验时间的延长呈整体下降趋势。结果如图1所示。

由试验结果可知，24 h时，接入C-2菌液的培养基中氨氮含量下降最为明显，下降28.5%。72 h时，C-2、C-3、T-1和N-3菌株的氨氮降解率分别为45.3%、33.8%、29.2%和20.8%，其中，C-2菌株的氨氮降解率最高。因此，C-2、C-3、T-1和N-3能够较好利用氨氮进行生长代谢，从而有可能减少鸡粪便中氨氮浓度，进而减少氨氮以气态挥发至空气中的趋势，有望净化鸡舍内环境。

图1 不同时间氨氮含量

3.3 氨氮降解菌减少氨释放量的特性研究

在鸡新鲜粪便中接入菌液4 d后，C-2、C-3、T-1、N-3菌株均能有效抑制鸡粪中氨气的产生，尤其加入C-2菌液的鸡粪便释放的氨气量下降最为明显，C-2菌液的加入使得鸡粪氨气的释放量平均减少0.11 g/kg鸡粪便，与对照组相比，抑制氨气排放率达到86.7%。因此，将C-2菌株作为备选菌株进行菌株的种属鉴定。

3.4 鉴定

3.4.1 形态观察

C-2菌株经24 h平板培养后，观察其在NA培养基上的菌落形态为圆形，边缘整齐，表面不光滑有褶皱，不产生色素。革兰氏阳性，菌体杆状，芽孢呈椭圆形中生。3.4.2 16S rDNA测序结果(见表1及图2)

表1 C-2菌株与参比菌株16S rDNA序列相似性比较

图2 16S rDNA序列系统发育树

由以上结果可知，与菌株C-2的16S rDNA序列同源相似性最高的9株标准菌株均属于芽孢杆菌属，其中有8株与菌株C-2的16S rDNA序列相应的同源相似度高于99%，Bacillus flavithermus与菌株C-2序列的同源相似度较低，但也有90.83%，因此可初步判断菌株C-2属于芽孢杆菌属。

3.4.3 生理生化鉴定

根据其特定的生化反应要求用相应的试剂鉴别，试验结果见表2。

表2 生理生化试验

将细菌C-2菌株的菌落形态、菌体特征、16S rD⁃NA序列分析结果和生理生化试验特征，与《常见细菌系统鉴定手册》相关内容对照，最终将其鉴定为枯草芽孢杆菌。

4 结论与讨论

本试验共分离筛选到的4株抑氨率较高的菌株，分别为C-2、C-3、T-1、N-3。其中，C-2的氨氮降解率最高，72 h达到45.3%。将该4种菌株分别接入鸡粪便后检测其减少氨释放量的程度，结果发现，均能够有效降低氨气的排放率，综合上述试验结果，将C-2菌株作为备选菌株进行生理生化、16S rDNA的鉴定。经鉴定，C-2菌株为枯草芽孢杆菌。现代家禽的集约化大规模养殖致使鸡舍内氨气浓度偏高，严重影响了动物的健康，同时会对养殖人员的健康和大气环境产生不利影响。筛选高效抑氨菌来减少氨气等有害气体的产生成为当前的热点。李军平[14]从鸡粪中分离得到一株能够有效降低鸡粪氨气释放量的枯草芽孢杆菌D3菌株。试验表明，麻鸡日粮中添加量为0.90×109cfu/kg体重时，氨气的排放量最低。陈国营等[15]在好氧条件下筛选到的B3菌株在菌液添加量为7.5 ml，鸡粪含水量为88.52%，6 d的抑氨效果可达66.67%。刘乃芝等[16]通过限制性培养基的初筛和抑氨富集培养基的复筛，并采用三角瓶封闭检测法进行实际除臭效果试验。结果发现，24 h时芽孢菌Y-64的除臭效果最好，达33.33%。本研究所研发的具有益生作用的枯草芽孢杆菌C-2菌株，抗逆性强，耐胆酸盐，能够高效降解鸡粪便中的氨氮，减少氨氮转化为气态氨的趋势，从而降低鸡舍内氨气含量，有效净化鸡舍内空气。未来可以采用直接喷洒液体菌液、固体菌粉的方式或加入到饲料中作为饲料添加剂使用。这不仅对于鸡舍内环境的改善有着积极作用，同时有可能通过菌株将氨氮转化为菌体蛋白，增加鸡粪便的可利用率，效果好、安全系数高，且绿色环保。本研究将进一步对该菌剂的应用方式及其减排机理做进一步研究，为将来的应用提供基础。