饲喂生物发酵饲料对延边黄牛背最长肌FABP4、CAPN1基因表达的影响

■冯 健 李英花 耿春银 严昌国

(延边大学农学院，吉林延吉133002)

1 试验材料

1.1 试验动物

选择12头平均体重（545.55±27.00）kg的体健无病延边黄牛阉牛，随机分成试验组和对照组,每组6头，试验组每头牛饲喂生物发酵饲料2 kg/d，对照组不饲喂生物发酵饲料,试验组和对照组的基础日粮营养水平基本相同。预饲期10 d，正式期90 d。屠宰后，分别从试验组与对照组各随机选取3头牛，在第14肋骨处采取背最长肌一小块，迅速放于事先处理好的冻存管中并置于液氮中速冻，-80℃保存待用。

1.2 试验日粮

生物发酵饲料是利用玉米粉40%、啤酒糟40%、糖蜜5%、酵母菌4%（微生物实验室培养)和水。混合均匀后在30℃下厌氧发酵3 d，制成具有酒香味，酒精度为7～9°的新型饲料。其日粮组成及营养水平见表1。

表1 供试牛日粮组成及营养水平

2 试验方法

2.1 引物设计与合成

根据GenBank中（牛）的FABP4基因序列（序列号：NM_174314.2）、CAPN1基因序列（序列号：NM_174259.2）和β-actin基因序列（序列号：AB098930.1），按照实时荧光定量PCR引物设计原则，用Oligo6.0软件设计特异性引物。内参基因是β-actin基因，表2为引物信息（引物由上海生工生物技术有限公司合成）。

表2 实时荧光定量PCR引物

2.2 背最长肌组织总RNA提取

利用TaKaRa公司的总RNA提取试剂盒提取供试牛背最长肌中的总RNA，整个操作过程在超净工作台中进行，不能有RNA酶的污染。

2.3 总RNA的检验

提取总RNA样品4 μl，用DEPC处理水稀释250倍，混合均匀后，测定260、280 nm吸光度（利用紫外分光光度计），确定溶液的OD260/OD280值是否在1.8～2.0区间之内，然后计算总RNA的浓度。

总RNA的浓度(ng/ml)=OD260×稀释倍数×50/1 000。

取总RNA样品5 μl（约6～8 μg的RNA），进行凝胶电泳分离，利用凝胶成像仪观察总RNA条带数量、清晰度和有无拖尾现象，其中18S和28S的条带亮度比约为2∶1。

全市每年都有因城市（镇）开发、工业园区、房地产、交通、水工程等建设项目开挖扰动地表、开挖自然山体，不严格执行水土保持方案和“三同时制度”，没有实施生态修复和水保设施建设，甚至有的建设单位不按规定倾倒或者向河道偷倒废弃建筑渣（土）等。据监测和调查，全市各类生产建设项目年造成新的水土流失面积10km2，有的地方破坏面积已接近甚至大于当年治理面积，城市生态环境严峻形势不容乐观。

2.4 反转录反应（RT-PCR）

总RNA提取后，利用TaKaRa公司的Prime ScriptÒ RT-PCR试剂盒进行反转录操作，向RNase free PCR反应管（200 μl）中加入表3中的溶液或试剂，整个过程全部在冰上完成，根据反转录试剂盒使用说明书，建立20.0 μl反转录体系。其条件和方法均按照反转录试剂盒使用说明书进行操作。

表3 反转录反应体系

2.5 PCR的扩增反应(见表4)

表4 PCR扩增反应体系

PCR的扩增起反应体系的混合是在冰上进行，反应体系为20.0 μl。

PCR反应程序为：预变性93℃ 5 min，变性93℃15 s，退火在54～60 ℃持续32 s，72 ℃延伸32 s，循环数为42个，72℃延伸16 min，4℃保存。

2.6 目的片段的回收

用琼脂糖凝胶电泳将上述产物分离，利用DNA回收试剂盒将目的片段回收。

2.7 序列分析

通过Blast程序和DNAman软件分析发现测序结果与Genbank中发表的相应序列相同。

2.8 实时荧光定量PCR

①反应温度的筛选。根据引物的退火温度，在实时荧光定量PCR仪上设置54～60℃，5个温度梯度，观察其溶解曲线及扩增曲线，找出适宜3个基因的反应温度。

②标准曲线的建立。将目的基因稀释，按照10倍梯度方法，然后对FABP4、CAPN1和β-actin三个基因进行扩增反应，按说明书的步骤进行操作，其反应体系为25 μl，最后得出每个目的基因的标准曲线。

③荧光定量PCR。采用SYBRÒ Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）试剂盒对β-actin、FABP4和CAPN1基因进行扩增。反应条件参考试剂盒进行(见表5)。

表5 荧光定量PCR反应体系

2.9 数据统计分析

根据荧光定量PCR检测出的内参基因和目的基因，利用2-ΔΔCt方法分析基因的相对表达差异量，试验数据一律采用统计软件SAS（V8.0）中的一般线性模型（GLM）模块来进行单因素方差分析。表中结果表示为“平均数±标准差”，P＜0.05为结果差异显著。

3 结果与分析

3.1 RNA及目的基因片段检测结果（见图1）

如图1可见，将提取的试验组与对照组牛背最长肌的总RNA进行电泳，将试验组3个个体和对照组3个个体的总RNA分别经紫外分光光度计分析，所有样本的D260/D280均在1.8～2.0。电泳结果表明，RNA分子保持完整RNA质量符合实时荧光定量PCR试验的要求。

图1 总RNA提取的电泳结果

常规PCR产物检测结果如图2。泳道1为CAPN1基因，泳道2为FABP4基因，泳道3为β-actin基因，从图中可以看出三个基因的条带均清晰明亮、无杂带，而且其片段的大小也都在预先设计的范围内，说明引物的特异性很高，测序结果与目的序列一致，确定为目的基因片段。

图2 目的基因的PCR检测结果

3.2 实时荧光定量结果与分析

3.2.1 内参基因与目的基因的标准曲线及溶解曲线

β-actin、FABP4和CAPN1基因的标准曲线均在100～10-3模板浓度范围内建立。β-actin、FABP4 和CAPN1基因的标准曲线如图3～图5，从图中我们可以看出，目的基因的Ct值与起始模板浓度的线性相关系数分别为0.998、1.000和0.999，线性关系很好，作为本试验的一个重要参数，对于采用Ct值基因进行准确的定量很有利。β-actin、FABP4和CAPN1基因的溶解曲线如图6～图8，从图中可以看出，目的基因的溶解曲线上未见杂峰，内参基因（β-actin基因）有杂峰信号出现，可能是引物二聚体或者是非特异性扩增产物，但它们的量与扩增子相比显得非常少，所以对定量结果影响不大。CAPN1、β-actin和FABP4基因的扩增曲线如图9～图11所示，横坐标为待测样品循环数Ct，纵坐标为荧光强度。Ct是荧光强度在被检测时所得到的对应的循环数。扩增曲线图反映了循环过程中荧光值的变化，即每个循环Ct值与起始模板浓度的对数成反比。

图3 β-actin基因标准曲线

图4 FABP4基因标准曲线

图5 CAPN1基因标准曲线图

图6 CAPN1基因溶解曲线

图7 FABP4基因溶解曲线

图8 β-actin基因溶解曲线

图9 CAPN1基因扩增曲线

图10 β-actin基因扩增曲线

图11 FABP4基因扩增曲线

3.2.2 FABP4、CAPN1基因mRNA在延边黄牛背最长肌组织中表达的差异

饲喂生物发酵饲料对延边黄牛牛背最长肌中FABP4、CAPN1基因表达的相对定量结果见表6。

表6 饲喂生物发酵饲料对黄牛背最长肌FABP4、CAPN1 mRNA相对表达量的影响

由表6可以看出，延边黄牛日粮中饲喂发酵饲料对牛背最长肌中FABP4具有极显著影响（P＜0.01）,当延边黄牛日粮中饲喂发酵饲料后，FABP4基因mRNA的表达量显著高于对照组,试验组中FABP4 mRNA的表达量是对照组的2.27倍。CAPN1 mRNA的表达量受日粮影响差异显著（P＜0.05），当延边黄牛饲饲喂发酵饲料后，黄牛背最长肌中CAPN1 mRNA的表达量显著高于对照组（P＜0.05）。

4 讨论

4.1 饲喂生物发酵饲料对延边黄牛背最长肌FABP4基因表达的影响

肌间脂肪（IMF）作为影响牛肉品质的一个主要因素，其含量与牛肉的嫩度和风味有着十分密切关系。Michal等[2]研究表明，FABP4基因在脂肪沉积中发挥重要的作用，与牛大理石花纹、皮下脂肪厚度呈显著相关。Cho等[5]的研究结果表明该FABP4基因与背膘厚相关。Shogo等[6]研究显示，FABP4基因与日本黑牛牛肉中脂肪酸的组成成分呈显著相关。Barendse等[7]发现，FABP4基因位于第3外显子和第3内含子之间存在一个剪接位点突变，该SNP与澳大利亚牛肌间脂肪沉积显著相关。

本试验采用荧光定量RT-PCR方法检测饲喂发酵饲料的延边黄牛和正常饲喂的延边黄牛FABP4基因mRNA表达进行研究，结果表明，FABP4基因在试验组和对照组牛背最长肌组织中均有表达，且试验组和对照组FABP4基因表达量相比，试验组显著高于对照组，说明饲喂发酵饲料可以增加肌间脂肪的沉积，改善牛肉的风味。

4.2 饲喂生物发酵饲料对延边黄牛背最长肌CAPN1基因表达的影响

嫩度作为衡量牛肉品质重要的指标。在不同品种和不同部位中差异很大，在不同部位中以背最长肌最具代表性。钙蛋白酶是影响肌肉嫩度的重要基因，它控制着肌纤维蛋白的降解，与宰后的嫩度变化有着非常密切关系[8]。作为最早发现的钙蛋白酶之一，钙蛋白酶Ⅰ即CAPN1基因，是由21个内含子和22个外显子组成[9]。Koohmaraie等[3]研究报道，半胱氨酸蛋白酶在肉质嫩化过程中起着非常重要的作用,而半胱氨酸蛋白酶就是由CAPN1基因编码所产生的，因此，CAPN1基因可作为研究肉质嫩度的主要候选基因。Koohmaraie等[3]的研究也发现CAPN1基因在肉质嫩化的过程中起着非常重要作用。Page等(2004)[4]研究中发现CAPN1基因是一个影响肉质嫩度的非常重要的遗传标记。Pinto等[10]研究表明，CAPN1基因对牛的肉质嫩度具有显著影响。

本试验采用荧光定量RT-PCR方法检测饲喂生物发酵饲料的延边黄牛和正常饲喂的延边黄牛CAPN1基因mRNA表达进行研究，结果表明，CAPN1基因在试验组和对照组牛背最长肌组织中均有表达，且试验组和对照组CAPN1基因表达量相比，试验组显著高于对照组，说明饲喂生物发酵饲料可提高延边黄牛牛肉嫩度。

5 结论

饲喂生物发酵饲料可显著提高FABP4、CAPN1基因在延边黄牛背最长肌中的表达量。