基于PCR技术的水貂毛皮鉴别研究

顾文佳+谭玉静+胡雪莲+钟蕾+陆壹+张奕南+段文锋

摘要：本研究应用荧光PCR技术鉴定水貂毛皮。方法建立：市场采购32件鞣制动物毛皮，提取足够的DNA，应用荧光PCR方法检测水貂成分；其中21件水貂毛皮检测到水貂成分，11件其他动物毛皮均未检出水貂成分，方法特异性达到100%。方法验证：市场采购10件毛皮服装样品，比较宏观法与PCR法结果；其中宏观法鉴定结果与PCR法一致，宏观法无法确定水貂的 4 件样品均可通过PCR法明确。本方法可用于水貂毛皮的鉴定，并作为宏观法的有效补充和验证。

关键词：水貂毛皮；鉴别；PCR方法

中图分类号：TS57 文献标志码：A

Identification of Mink Fur Based on PCR Method

Abstract： The study relates to the identification of mink fur based on PCR method. Test method was established by extracting enough DNA from 32 samples of tanned animal fur from market and employing the PCR method to identify the samples. After testing， 21 samples were proved to contain key constituent of mink， while the other 11 samples were component-free by PCR method with the specification of 100%. This test method was validated by comparing the results of conventional and PCR method respectively for 10 fur coat samples from the market. The results of conventional method were identical with PCR method， and 4 samples that couldnt be identified by the conventional method were measured by the PCR method. Eventually， the PCR method can be used in the field of identification of tanned mink fur and as supplement and verification for optical method.

Key words： mink fur； identification； PCR method

貂皮素有“裘中之王”之称，其种类繁多，有水貂、石貂、松貂、渔貂、扫雪貂等品种，其中以水貂最为常见，紫貂最为名贵。目前，毛皮鉴定常采用宏观观察法和显微镜观察法，尚无可靠、稳定、可重复的标准鉴别方法。一些形态接近或经过特殊处理工艺的皮毛样品鉴定仍存在难点，如黄狼皮与水貂毛皮在电子显微镜下也难以区别。某些商家利用消费者缺乏皮毛知识和鉴别经验，在商品上标示山貂、黄金貂、艾狐貂、青根貂等近似的名称或类别，混淆消费者。因此，如何方便、准确、快速地鉴别毛皮种类一直是质检部门和广大消费者关注的焦点。

本研究拟探索在分子水平上实现物种鉴别，突破传统方法依据动物纤维形态结构鉴别的局限性，更加客观、稳定。但是，由于动物毛皮经过鞣制、漂白和染色处理，鞣制皮张中的DNA高度降解，且含有大量的酶抑制物，因此提取足够量的DNA成为应用PCR检测的技术难点。本文通过研究鞣制貂毛皮的DNA提取技术，得到稳定可靠的DNA，利用PCR技术鉴别水貂毛皮，并与宏观观察法、显微镜观察法相比较，为貂毛皮的鉴别检测提供一个可靠的检测方案。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用水貂、紫貂、艾虎等鞣制动物毛皮购自大连某貂业有限公司、河北大营毛皮市场、桐乡皮草大世界；加工过程中的水貂毛皮购自桐乡某皮草有限公司。貂毛皮成衣购自河北大营毛皮市场、海宁皮革城和淘宝、京东等网络店铺。

裂解液：2%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、1.4 mol/L NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl、0.02 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）pH值8.0；DNA提取试剂盒（Roche，11796828001）；PCR预混液Premix Ex Taq （TaKaRa，RR390）。

1.2 仪器与设备

7500fast荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；6870冷冻研磨机（美国SPEX SamplePrep公司）；DS-11超微量分光光度计（美国DeNovix公司）；5415R离心机（德国Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 鞣制毛皮DNA的提取

鞣制皮张在平整处取约 4 cm2，成衣在腋下、底边处分别取样，各 4 cm2。将皮张剪成直径 5 mm左右小块，使用冷冻研磨机研磨成粉末。然后，称取0.5 g左右样品，加入 5 mL裂解液和40 μL蛋白酶K，置于56 ℃水浴锅中过夜裂解。加入等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇（25∶24∶1，v/v/v）。颠倒混匀后，10 000 g离心 5 min。取上清，加入等体积三氯甲烷-异戊醇（24∶1，v/v），混匀后10 000 g离心5 min，转移上清至另一离心管中，加入0.8倍异丙醇混匀，4 ℃下10 000 g离心10 min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀1 次，4 ℃下12 000 g离心10 min，弃上清，室温下晾干。沉淀加入200 μL 0.1×TE缓冲液（10 mM Tris–HCl，1 mM EDTA；pH值8.0）。按照Roche DNA提取试剂盒说明将提取的DNA过柱，提取的DNA稀释至20 ng/μL左右 4 ℃备用。

1.3.2 引物及探针

引物及探针由上海英俊生物技术服务有限公司合成，其序列如表 1 所示。

1.3.3 荧光定量PCR扩增体系及条件

荧光定量PCR反应体系为20 μL，包含DNA模板 1～2 μL（约含20 ng DNA），Real Time PCR预混液10 μL，Rox 0.4 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.4 μL，探针（10 mmol/L）0.6 μL，以超纯水补足体积。

荧光定量PCR仪反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火34 s，40个循环。使用ROX染料对荧光数值进行校正。

阳性、阴性及空白对照扩增正常，内参基因扩增Ct值< 30，且水貂目标基因扩增Ct值<40，判定为检出水貂成分。

1.3.4 水貂成分的特异性检测

收集国内大型水貂养殖场养殖的有代表性的杂交水貂、进口纯种水貂鞣制的皮张21条（包括不同加工过程、不同颜色、不同产地的水貂毛皮），以及常见用于冒充水貂毛皮的动物毛皮11条（包括紫貂、青根貂各 3 条，黄狼皮 2条，扫雪貂、艾虎、河狸各 1 条），按1.3.1的方法提取DNA，并按照1.3.3的方法检测内参基因和水貂成分。

1.3.5 市售貂毛皮服装材质鉴定

在市场随机购入标示为“貂毛皮”的服装10件，由检验人员依据上海市社会团体标准T31/07001-C001 — 2014《皮革和毛皮 材质鉴别 通用方法》，使用宏观观察法和光学显微镜检测动物毛皮，判定服装主要材质。同时，自服装上取样，按1.3.1的方法提取DNA，并按照1.3.3的方法检测内参基因和水貂成分。将 2 种方法进行对比。

2 结果

2.1 鞣制毛皮DNA提取质量

对水貂毛皮及其他动物毛皮共计32条按照1.3.1的方法提取鞣制毛皮DNA，A260/A280均在1.8 ～ 2.0之间，A260/ A230均大于 1，提取的DNA质量满足PCR实验要求。

提取的DNA按照1.3.3方法扩增内参基因12S rRNA，Ct值均小于30，平均为25.15±3.68。本方法提取到了足够的DNA，质量满足后续PCR实验要求。PCR扩增曲线如图 1所示。

2.2 水貂成分的特异性检测

水貂毛皮及其他动物毛皮共计32条，按照1.3.3方法扩增水貂特异性基因Cyt b，水貂毛皮Ct值均小于35，平均为27.34±2.01，扩增曲线如图 2 所示；其他动物毛皮扩增Ct值均大于40。本方法所选取水貂引物和探针具有高度的特异性，在荧光PCR反应体系中只有水貂成分能被扩增，其他易与水貂混肴的动物毛皮均未被扩增。

2.3 市售貂毛皮服装的检测

为验证本方法的准确性和适用性，将购得的10件成品服装先通过宏观观察法、光学显微镜法进行材质鉴定；然后通过本文建立的DNA方法检测水貂成分，最后与标签标识进行比较（表 2）。如服装有毛领，则计为 2 件样品，共计14件检测样品，检测结果如表 3 所示。

10件成衣的14件样品中，宏观法检测无法确定的样品为 4 件（占28.6%），均可通过PCR法检测确定是否为水貂毛皮。宏观法检测可以确定的10件样品，PCR法检测结果均与之一致。标签标示内容与材质鉴定结果完全一致的仅有 5 件，其中只有 1 件成衣的标签标示与材质鉴定结果完全一致。

3 讨论

本研究成功建立了从鞣制动物毛皮上提取足够用于进一步PCR检测的DNA方法。貂毛皮在鞣质加工时需要进行浸酸、油鞣、铝鞣，达到去油软化的目的，而且为了加工服装的需要还要染色、铬鞣。本研究选择了不同加工过程中的水貂毛皮，以及不同色泽的鞣制成品进行DNA提取，经过DNA含量和纯度检测、内参基因扩增证实均提取到了可靠的可用于PCR反应的DNA，满足后续实验需求。

在食品和饲料领域，DNA分析法早已成功地建立了多种物种鉴别的方法。如SN/T 3730 — 2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴别方法》提供对貂、狐狸、马等多种物种的鉴别方法，可以满足动物纤维和皮革的鉴别需求。本研究在成功提取出鞣制毛皮DNA后，直接采用标准方法中的引物和探针应用于动物毛皮的鉴别，成功地鉴别出全部的水貂毛皮，引物特异性为100%。比前人研究结果特异性66.7%有较大提高。在毛皮成衣服装的鉴别中，与宏观法比较，宏观法无法确定皮革种类的，PCR法可以确定是否为水貂成分；宏观法能够确定的，PCR法则与之结果一致。但对其它种属的貂毛皮（如紫貂、松貂和石貂），以及黄狼、青根貂、兔毛皮的鉴别还待进一步实验，分别设计出针对不同物种的特异性引物，以便能够更全面地鉴别动物毛皮品种。

综上所述，本研究建立了分子生物学水平的水貂毛皮鉴别方法，能够准确、客观地鉴别经过加工的水貂毛皮，且该方法具有稳定性、可重复性。不足之处在于必须对毛皮服装进行破坏性采样，影响服装成品的销售。本方法宜作为宏观观察法和显微镜检测法的补充确认方法，当交易中产生疑问时提供客观结果。

参考文献（略）