组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸联合姜黄素对MCF—7R乳腺癌细胞增殖抑制的影响

楼亚玲+++曹恒斌

[摘要] 目的 探讨丙戊酸（VPA）联合姜黄素（CUR）对人乳腺癌耐药细胞MCF-7R增殖抑制的影响及其作用机制。方法 分别用100、10、1、0.1、0.01 μg/mL阿霉素（ADR）作用于MCF-7R细胞和敏感株细胞MCF-7细胞72 h后，MTT法测定ADR对各组细胞的抑制率，计算半数抑制浓度（IC50），判定MCF-7R细胞的耐药情况；用20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L VPA、空白对照及320、160、80、40、20、10、5 μmol/L CUR、空白对照分别作用于MCF-7R细胞24、48及72 h，用MTT法分析细胞增殖抑制率；将VPA 0.625 mmol/L分别与10、20、40 μmol/L CUR联合作用于MCF-7R细胞 24、48及72 h后，用MTT法分析联合用药细胞增殖抑制率及Q值；将VPA 0.625 mmol/L与10 μmol/L CUR联合作用于MCF-7R细胞 48 h后，高倍显微镜下观察细胞形态及数量变化。 结果 MCF-7R与MCF-7细胞IC50分别为（60.30±20.30）、（5.59±1.87）μg/mL，MCF-7R细胞耐药倍数约为10.8倍。不同浓度VPA或VPA处理对数生长期MCF-7R细胞24、48及72 h后，结果提示对VPA或VPA对MCF-7R细胞的抑制作用与药物浓度和时间相关（P < 0.05）；联合用药结果显示，在相同作用时间下，CUR浓度越高，抑制率越高（P < 0.05）。金正均Q值法判断两药联用结果显示，0.625 mmol/L VPA与10 μmol/L CUR联合作用48 h时两药有明确的相加作用（P < 0.05），而其他联合用药及作用时间表现出两药拮抗作用，其中各联合用药组作用48、72 h时的Q值比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），而作用24 h时Q值比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。单用0.625 mmol/L VPA见少量细胞减少；10 μmol/L CUR也可导致较多细胞死亡，两药物联用时较单独用药细胞数量减少明显。 结论 VPA及CUR在低剂量联用时存在相加作用，高剂量联用时两者呈现拮抗作用。

[关键词] 丙戊酸；姜黄素；MCF-7R；增值抑制

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）10（a）-0021-04

Inhibitory effect of HDACi VPA combined with CUR on proliferation of breast cancer MCF-7R cells

LOU Yaling CAO Hengbin

Department of Pharmacy， Huzhou Central Hospital， Zhejiang Province， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To investigate the proliferation and inhibition of valproic acid （VPA） and curcumin （CUR） on human breast cancer cells （MCF-7R）， and the effect of proliferation mechanism on MCF-7R cell. Methods The different concentrations of 100， 10， 1， 0.1， 0.01 μg/mL ADR on MCF-7 and MCF-7R cells after 72 h ， the proliferation inhibition rate was analyzed with MTT assay， and inhibitory concentration （IC50） was computed； the different concentrations of 20， 10， 5， 2.5， 1.25， 0.625， 0.3125 mmol/L VPA and blank control， the different concentrations of 320， 160， 80， 40， 20， 10， 5 μmol/L CUR and blank control on MCF-7R cell after 24， 48 and 72 h， the proliferation inhibition rate was analyzed with MTT assay and the proliferation inhibition rate value was computed； 0.625 mmol/L VPA was combined with 10， 20， 40 μmol/L CUR on MCF-7R cell after 24， 48 and 72 h， the cell proliferation inhibition rate was analyzed with MTT assay and the proliferation inhibition rate value was computed； 0.625 mmol/L VPA and 10 μmol/L CUR on MCF-7R cell after 48 h， the changes of cells number and morphology were observed. Results IC50 of MCF-7R and MCF-7 cell was （60.30±20.30）， （5.59±1.87） μg/mL， respectively， the resistant factor of MCF-7R cell was about 10.8. The effect of different concentrations of VPA and CUR on MCF-7R cell after 24， 48 and 72 h was depended on the concentrations and time （P < 0.05）； the combined effect showed that， the higher concentrations of CUR， the bigger IR-values on the same time （P < 0.05）. The Jin zheng-jun Q-value method showed that， only 0.625 mmol/L VPA combined with 10 μmol/L CUR had additive effection （P < 0.05）， other combination groups and dealt time had antagonistic effection （P < 0.05）， and the Q-value of each combination group after 48， 72 h had statistically significant difference （P < 0.01）， while the 24 h group did not have significant difference （P > 0.05）； the reducing of the number of cells in 0.625 mmol/L VPA treatment group was not obvious， many apoptosis was leaded by 10 μmol/L CUR， and the combination of VPA 0.625 mmol/L and CUR 10 μmol/l decreased more than the monotherapy group. Conclusion VPA combined with CUR has synergistic effect on low dosage， but has antagonistic effect on high dosage.

[Key words] Valproic acid； Curcumin； MCF-7R； Inhibitory effect

乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，20世纪末的统计资料表明，全世界每年约有130万人被诊断为乳腺癌，在我国，乳腺癌在城市的发病率为女性肿瘤的第二位，在农村为第五位[1]。化疗耐药和转移复发是乳腺癌难以根治的主要原因，化疗有效率仅为40%～80%[2]。现研究认为，丙戊酸（VPA）和姜黄素（CUR）对人类肿瘤细胞均存在较强的抗肿瘤活性，且毒副作用小[3-6]，将它们应用于临床治疗肿瘤及改善肿瘤耐药问题均表现出良好的应用前景。本研究主要采用VPA联合CUR作用于MCF-7R和MCF-7细胞，在体外评价两药合用效果并探讨其合用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

VPA（Sigma公司）；阿霉素（浙江海正药业股份有限公司，批号：130707）；CUR（Alddin公司，批号：C1213019）；四氮唑蓝、胎牛血清及DMSO（Amresco公司）；MEM、DMEM、青霉素/链霉素及胰蛋白酶（Gibco公司）；人乳腺癌耐药细胞株MCF-7R和人乳腺癌敏感株MCF-7（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MCF-7R（MCF-7）细胞由含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL），链霉素（100 U/mL）培养基（DMEM）培养，于37℃（5%CO2，95%空气），饱和湿度，待细胞生长至85%左右融合，用0.25%胰蛋白酶液消化后进行传代。MCF-7R耐药细胞除上述条件外，需加入1.0 μg/mL的阿霉素，以维持细胞的耐药性，实验前2周停药。CUR由二甲基亚砜（DMSO）稀释为100 mmol/L母液，分装，避光-20℃冰箱保存，2周内有效，使用前以无血清培养基稀释至所需浓度，使DMSO终浓度<0.1%；VPA由PBS液稀释为1 mol/L母液，0.22 μm针式滤器过滤除菌，分装，-20℃冰箱保存，使用前以无血清培养基稀释至所需浓度。

1.2.2 细胞增殖检测（MTT） 取对数生长期MCF-7R及MCF-7细胞，1000 r/min离心5 min，弃去上清培养液，用含10%FBS的MEM及DMEM培养液重悬并打匀后，用血细胞计数板计数，将细胞液稀释至5×104个/mL接种于96孔培养板，每孔100 μL，37℃、5%CO2过夜贴壁培养24 h后，分别加入不同浓度的ADR溶液，使细胞培养液浓度梯度为100、10、1、0.1、0.01 μg/mL，药物作用72 h后，每孔加入20 mL MTT溶液（2.5 mg/mL，现配现用），置于细胞培养箱中孵育4～6 h后，吸弃细胞上清液，每孔加入100 mL DMSO，轻微振荡，待甲瓒完全溶解后用自动酶标仪于490 nm处测定吸光度值（OD值）。取对数生长期MCF-7R细胞按上述方法处理，37℃、5%CO2过夜贴壁培养24 h后，分别加入不同浓度的VPA溶液，使细胞培养液浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L，24、48、72 h后得到相应浓度及时间下的增殖抑制率，并根据这个结果选择后续试验VPA浓度；取对数生长期MCF-7R细胞，按上述方法处理，加入不同浓度的CUR溶液，使细胞培养液浓度梯度为320、160、80、40、20、10、5 μmol/L，24、48、72 h后得到相应浓度及各时间下的增殖抑制率及各时间段的半数抑制浓度，根据结果选择后续试验浓度，每组实验均设空白对照，分别设3个复孔，实验重复3次。用酶标仪测定OD值，细胞增殖的抑制率（IR%）=（1-OD实验组/OD对照组）×100%。

1.2.3 合并用药效果评价 评价联合用药对肿瘤细胞的抑制是否有协同作用，参照金正均Q值法判断：Q=Ea+b/（Ea+Eb-Ea×Eb），其中Ea+b为合并用药的抑制率，Ea和Eb分别为A药和B药单独用药的抑制率。Q<0.85为拮抗，0.85≤Q<1.15为相加，Q≥1.15为协同[7]。

1.2.4 细胞形态观察 取对数生长期MCF-7R细胞，以5×104/孔接种于96孔板，37℃、5%CO2孵箱培养24 h后，加入终浓度为0.625 mmol/L VPA、10 μmol/L CUR、0.625 mmol/L VPA+10 μmol/L CUR与联合处理48 h后，在倒置显微镜下观察细胞形态及数量变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验；IC50用Probit回归法计算，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADR对MCF-7R/MCF-7细胞增殖的影响

用100、10、1、0.1、0.01 μg/mL ADR处理对数生长期的MCF-7R细胞及MCF-7细胞72 h，根据OD值计算抑制率，用Probit回归法计算IC50。阿霉素对MCF-7R细胞及MCF-7细胞作用的IC50分别是（60.30±20.30）、（5.59±1.87）μg/mL，MCF-7R耐药倍数约为10.8倍。

2.2 VPA对MCF-7R细胞的增殖抑制作用

20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L VPA及空白对照处理对数生长期MCF-7R细胞24、48及72 h，根据OD值计算抑制率，提示各组VPA对MCF-7R细胞抑制作用与浓度和时间相关（P < 0.01），见表1。因VPA在临床治疗应用中浓度监测安全范围为50～100 μg/mL，尽量减少药物细胞毒性作用对结果的影响，该实验VPA浓度应选为0.625 mmol/L[8]。

2.3 CUR对MCF-7R细胞的增殖抑制作用

320、160、80、40、20、10、5 μmol/L CUR及空白对照处理对数生长期的MCF-7R细胞24、48及72 h后，根据OD值计算抑制率。结果，CUR对MCF-7R细胞抑制作用与浓度和时间相关（P < 0.01），见表2。Probit回归法计算CUR 24、48及72 h IC50，分别为23.7、49.8和38.6 μmol/L，该实验CUR后续浓度为10、20、40 μmol/L。

2.4 VPA联合CUR对MCF-7R细胞增殖的影响

0.625 mmol/L VPA分别作用于40、20、10 μmol/L CUR处理对数生长期的MCF-7R细胞24、48及72 h后，根据OD值计算抑制率。结果显示，在相同作用时间下，抑制率的高低取决于CUR的浓度，CUR浓度越高，抑制率越大（P < 0.01）。

2.5 金正均Q值法判断两药联用效果

采用金正均Q值公式计算Q值，分析VPA联合CUR对MCF-7R细胞增殖抑制率的增强是否具有协同作用。Q<0.85为拮抗，0.85≤Q<1.15为相加，Q≥1.15为协同。结果显示，当CUR为10 μmol/L作用48 h时，两药物联合有明确相加作用（P < 0.01）；而各联合用药组作用24、72 h时及20、40 μmol/L CUR联合0.625 mmol/L VPA作用48 h时均表现出拮抗作用。各联合用药组作用48、72 h时Q值比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），作用24 h时比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.6 联合用药对细胞形态及数量的影响

空白组与单独使用0.625 mmol/L VPA组48 h后细胞增殖状态良好，数目形态未见明显变化；单独使用10 μmol/L CUR组数目稍有减少，0.625 mmol/L VPA+10 μmol/L CUR处理组，数目形态发生较为明显改变，可见少量细胞形态不规则，体积变小，大小不等，培养基中可见少许的细胞碎片及死亡细胞。

3 讨论

VPA是广谱组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可通过诱导细胞周期停滞、细胞凋亡和分化，抑制肿瘤细胞生长增殖等途径达到较强抗肿瘤活性[3-6]。VPA可增强多种抗肿瘤药物对肿瘤细胞的疗效，例如VPA增强顺铂对小细胞肺癌的作用，其机制是通过线粒体途径诱导细胞凋亡，VPA抑制组蛋白去乙酰化酶3的表达，上调P21，并抑制Bcl-xL的表达，从而增强顺铂的抗肿瘤作用[9]。另外VPA联合RAS抑制剂抑制非小细胞肺癌的增殖，因阻碍Survivin与Aurora A的表达[10]。

CUR具有一定的抗肿瘤作用，能抑制多种肿瘤细胞的生长、促进分化、诱导凋亡等作用[4，11]。CUR可介导细胞内信号，CUR可通过作用不同分子靶点导致肿瘤细胞的凋亡及细胞周期的抑制，例如上调cdk抑制剂、P53，下调CyclinD1、cdk-1、cdk-2、NF-kB[12]，并可增强顺铂或奥沙利铂抗肿瘤作用，并能逆转肿瘤细胞的耐药性[13-15]，且与下调P-gp蛋白、多药耐药相关蛋白MRP-1等蛋白表达有关[16-17]。CUR的多效活性取决于其复杂的化学组成，故其可作用于多条信号途径，包括NF-kB、Akt、生长因子、依赖于Nrf2细胞保护途径、转移和血管生长途径等[18]。

Fortunati等[19]将适合人体浓度的VPA作用于MCF-7细胞，发现其能诱导P21表达，使细胞周期停滞于G1期，下调Bcl-2及上调Bak表达，从而诱导乳腺癌细胞凋亡。另有文献报道VPA与CUR联合作用于人白血病细胞，通过作用于组蛋白乙酰化酶，导致白血病细胞的凋亡[20]，然而目前尚未有文献报道VPA和CUR联合作用于乳腺癌耐药细胞MCF-7R。本研究发现不同浓度的VPA及CUR作用于MCF-7R细胞的增殖抑制作用呈现时间与浓度依赖性，两药联用时0.625 mmol/L VPA+40 μmol/L CUR组各时间点抑制率均为最高，但在此浓度下两药并未呈示相加或协同作用。只有0.625 mmol/L VPA+10 μmol/L CUR作用48 h时提示存在相加作用（P < 0.05），其余各组均呈拮抗作用，但作用24 h各组抑制率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。从对细胞形态及数量的影响发现，联合用药组细胞数量比单药作用减少明显，但不显著。两药在低剂量联用时存在相加作用，高剂量联用时呈拮抗作用，推测两药存在同一作用靶点或通路，尚待进一步深入研究。

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（收稿日期：2016-06-03 本文编辑：任 念）