金水鲜联合放疗对A549细胞凋亡及HIF—1α、VEGF表达的影响

储音越等

[摘要] 目的 观察金水鲜联合放疗对肺腺癌A549细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，并对其可能的机制进行探讨。 方法 常规培养细胞，随机分为四组：①对照组（NC组），加入50 μL生理盐水；②放疗组（RT组），单次照射，剂量2 Gy；③金水鲜组（JSX组），加入50 μL金水鲜；④金水鲜联合放疗组（JSX+RT组），加入50 μL金水鲜后对细胞进行单次放射线照射，剂量为2 Gy。CCK8测量实验组细胞增殖抑制率，酶联免疫吸附测定（ELISA）及Real Time-PCR检测各组HIF-1α、VEGF的表达情况。 结果 CCK8结果显示，JSX+RT组增殖抑制最明显（P < 0.05）。ELISA结果显示，在24 h时JSX+RT组HIF-1α、VEGF蛋白表达量分别为（284.27±2.66）、（462.40±3.58）pg/mL。RT-PCR结果显示，与其他各组比较，JSX+RT组HIF-1α、VEGF表达量明显下降（P < 0.05）。 结论 金水鲜联合放疗具有抑制肿瘤细胞增殖及HIF-1α、VEGF表达的能力。

[关键词] 肺腺癌；金水鲜；放射治疗；缺氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）10（a）-0004-05

Effect of Jinshuixian combined with radiotherapy for the apoptosis of A549 cells and the expression of HIF-1α and VEGF

CHU Yinyue1 GE Wei1 SONG Jing1 ZHOU Fangzheng2 ZHOU Haibo2 ZHANG Dongsheng2 NIE Long2 SUN Yanyan2

1.Department of Cancer Center， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China； 2.Department of Oncology， Suizhou Central Hospital， Hubei Province， Suizhou 441300， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Jinshuixian combined with radiotherapy on the expression of hypoxia inducible factor-1 alpha （HIF-1α） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in A549 cells of lung adenocarcinoma， and to explore its possible mechanisms. Methods The cells were cultured generally， and they were randomly divided four groups： ①control group （NC group） was added with 50 μL saline； ②radiotherapy group （RT group） was given single irradiation， the radiation dose was 2 Gy； ③Jinshuixian group （JSX group） was added with 50 μL Jinshuixian； ④Jinshuixian + radiotherapy group （JSX+RT group）， the cells were irradiated with a single radiation dose of 2 Gy after added 50 μL Jinshuixian. The CCK8 assay was used to measure the proliferation inhibitory rates of experimental groups， enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and real time-PCR were introduced to test the expression of HIF-1α， VEGF. Results CCK8 test showed that the capable of inhibiting proliferation of JSX+RT group was the highest （P < 0.05）. ELISA experiment showed that the expression of HIF-1α， VEGF in JSX+RT group were （284.27±2.66）， （462.40±3.58） pg/mL in 24 h. RT-PCR experiment revealed that the expression of HIF-1α， VEGF in JSX+RT group were obviously lower than other groups （P < 0.05）. Conclusion Jinshuixian combined with radiotherapy has the ability of blocking proliferation and inhibiting the expression of HIF-1α and VEGF.

[Key words] Lung adenocarcinoma； Jinshuixian； Radiotherapy； Hypoxia induced factor-1α； Vascular endothelial growth factor

在我国肺癌的发病率及病死率均居前位[1]，5年生存率较低，仅为18%左右。由于早期缺乏特异性临床表现，大多数患者在确诊时已是临床晚期[2]，失去了手术的机会。大部分的患者需要接受放射治疗，放疗破坏肿瘤细胞DNA等遗传物质发挥杀伤作用，促进肿瘤细胞死亡。但放疗靶区周围正常组织以及心血管等重要的组织器官对放疗剂量的最大承受力是目前提高靶区放疗剂量的重要限制因素。因此对放疗增敏靶点的研究及联合治疗的探究是目前的研究热点之一。近年来，我国自主研发的具有抗肿瘤血管生成作用的中药越来越多，如金龙胶囊、金水鲜胶囊已受到业内的广泛关注，然而其联合应用提高疗效的机制正在研究中。金水鲜具有减轻患者症状、改善患者生活质量、减轻放化疗副作用、改善治疗效果等作用[3]。对于金水鲜联合放疗可提高放疗的效果，在近期研究中有报道，通过抑制肿瘤血管新生可能是其提高放疗效果的有效机制[4]。有研究发现，现代鲜药金龙胶囊具有抑制肺腺癌A549的增殖能力，并能诱导其凋亡[5]，在动物模型中一定浓度的金龙胶囊可以抑制新血管网络的形成[6]。1990年，Folkman博士提出的Folkman理论，为血管内皮生长因子（VEGF）的临床应用提供基础。VEGF对血管的通透性有促进作用，内皮细胞是VEGF的主要靶点，肿瘤细胞释放的VEGF导致肿瘤血管的生成。Fang等[7]证明三羟黄酮通过降低肿瘤组织内缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和VEGF的表达，明显抑制活体内肿瘤血管的发生，且HIF-1α与VEGF的关系非常密切。本实验通过观察金水鲜联合放疗对肺腺癌A549细胞HIF-1α、VEGF蛋白及mRNA表达的影响，进而探讨金水鲜联合放疗能否对HIF-1α、VEGF产生明显抑制及其临床意义，对抗血管生成治疗理论进行补充。

1 材料与方法

1.1 材料

A549人肺腺癌原代细胞购于武汉大学细胞典藏中心，金水鲜胶囊冻干粉（北京建生药业有限公司惠赠，中国），CCK8试剂盒（碧云天，中国），Trizol（Invitrogen公司，美国），SYBRR Green Real time PCR Master Mix（TOYOBO公司，日本），PCR引物（谷歌生物，中国），HIF-1α ELISA试剂盒，VEGF ELISA试剂盒（Santa Cruz公司，美国），1640培养基、胎牛血清、双抗（HyClone 公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 用含胎牛血清的1640培养基培养肺腺癌A549细胞，放入温度为37℃、CO2浓度为5%的恒温培养箱中常规培养后，随机分为四组：①对照组（NC组）：50 μL生理盐水；②放疗组（RT组）：放射线剂量2 Gy，单次照射，照射源距离细胞表面的距离为1 m左右；③金水鲜组（JSX组）：50 μL金水鲜加入一定体积的培养液中；④金水鲜联合放疗组（JSX+RT组）：50 μL金水鲜加入一定体积的培养液后迅速对细胞进行单次放射线照射，剂量为2 Gy，照射源距离细胞表面的距离为1 m左右。处理所用药物为金水鲜胶囊冻干粉，用生理盐水稀释，配成50 mg/mL金水鲜胶囊悬液。

1.2.2 CCK8测定肿瘤细胞增殖情况 制细胞悬液，计数并调整细胞浓度，在96孔板中接种，培养，过夜。同时设置空白组，即仅含培养基不含细胞；并在96孔板周围隔空加100 μL PBS。按实验分组分别处理细胞，每组5个复孔，37℃培养。处理后分别培养6、12、18、24 h后每孔加入10 μL CCK8溶液，37℃孵育2 h。OD450测定各孔吸光值。

1.2.3 ELISA法检测各组 HIF-1α、VEGF蛋白表达情况 分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔，向标准品孔加入稀释好的标准品100 μL，在待测样品孔中先加样品稀释液80 μL及待测样品20 μL，轻摇，37℃孵育30 min；弃反应液，甩干，洗涤液洗涤，轻摇30 s，去洗涤液，用吸水纸拍干，重复5次，每次浸泡1～2 min；除空白孔外，每孔加入酶标试剂100 μL，轻摇，37℃，30 min；弃反应液，洗涤液洗涤，方法同上；每孔加入显色剂A 100 μL，再加入显色剂B 100 μL，轻摇，37℃避光，30 min；取出酶标板，加入终止液50 μL，终止反应，观察颜色变化；以空白孔调零，酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度（OD值）。根据标准品浓度及对应OD值计算出标准曲线的直线回归方程，根据样品OD值及回归方程计算对应样品浓度。实验重复3次。

1.2.4 RT-PCR检测各组HIF-1α、VEGF信使RNA表达差异 提取各组细胞RNA，以b-actin为内参，其基因序列是F 5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTC-3'，R 5'-TAAAGACCTCTATGCCAACAC-3'；HIF-1α：F 5'-TGATGACCAGCAACTTGAGG-3'，R 5'-TGGGGCATGG TAAAAGAAAG-3'；VEGF：F 5'-ACATCTTCAAGCCG TCCTGT-3'，R 5'-GCATTCACATCTGCTGTGCT-3'。逆转录cRNA，反应体系RNA 4.744 μg；Oligo（dT）15（10 μmol/L）2 μL；dNTP（2.5 mmol/L）2 μL；dd H2O（Rnase free）Up to 14.5 μL。半定量RT-PCR检测，b-actin f（10 μmol/L）0.5 μL；b-actin r（10 μmol/L）0.5 μL；dNTP（2.5mmol/L）2 μL；Ex Taq 0.25 μL；10×Ex Taq E buffer 2.5 μL；cDNA 1 μL；dd H2O Up to 25 μL。实时荧光定量PCR，b-actin f（100 μmol/L）0.4 μL；b-actin r（100 μmol/L）0.4 μL；SYBR Green/Flourescein 10 μL；qPCR Master Mix（2X）H2O 5.4 μL。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；扩增循环条件为：94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 40 s，共40个循环。每个反应管荧光信号值到达设定的阈值所经历的循环数即Ct值。采用ΔΔCt的方法计算HIF-1α、VEGF mRNA的相对表达水平。

1.3 统计学方法

使用统计软件SPSS 18.0对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组均数间的比较使用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同处理方式对各组A549细胞抑制情况

各个不同处理组的肺腺癌A549细胞生长抑制率不同，具有明显的时效性，抑制作用随着处理时间的延长而增强。其中JSX+RT组与RT组对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用较JSX组更为明显（P < 0.05），RT组对A549细胞生长抑制率与JSX组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

表1 不同处理组肺腺癌A549细胞不同时间点的抑制率（%，x±s，n = 4）

注：与RT组比较，*P < 0.05；与JSX组比较，#P < 0.05；RT：放疗；JSX：金水鲜

2.2 各组A549细胞中HIF-1α、VEGF蛋白表达情况

与NC组比较，各处理组A549细胞HIF-1α、VEGF的表达量均有呈下降趋势，且JSX+RT组在24 h时HIF-1α、VEGF表达量显著下降。统计分析显示，在处理前（0 h）各个不同处理组中HIF-1α、VEGF的蛋白表达量比较差异无统计学意义（P > 0.05）。处理后24 h内，与NC组比较，各处理组HIF-1α、VEGF表达量均有所下降；处理24 h时，与其他各组比较，JSX+RT组HIF-1α、VEGF蛋白均明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2～3。

2.3 各处理组A549细胞中HIF-1α、VEGF mRNA表达情况

经RT-PCR扩增后，统计分析显示，在处理前（0 h）各个不同处理组中HIF-1α、VEGF mRNA表达量差异无统计学意义（P > 0.05）。处理后24 h内各处理组HIF-1α、VEGF mRNA表达量均有所下降；但在处理24 h时，JSX+RT组与其他各组比较，HIF-1α、VEGF mRNA明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05），JSX组与NC组比较差异也有统计学意义（P < 0.05）。见表4～5。

3 讨论

据最新调查研究显示[8-9]，2012年全球有820万人死于癌症，预计到2030年每年死于癌症的人口将达到1300万人。肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，放化疗是其晚期患者术前及术后常用的辅助治疗手段，以达到对肿瘤的最大杀伤及控制，提高患者的生存时间，降低手术复发率[10-11]。但，目前，肺癌患者的治疗现状并不乐观。近年来随着基因工程的大力发展，靶向治疗成为治疗肿瘤的重要手段。Folkman学者在20世纪70年代提出肿瘤新生血管在肿瘤发展中的重要意义，肿瘤细胞的增殖依赖其新生血管供氧及能量，且转运代谢产物，如CO2、乳酸等。有研究发现[12]，肿瘤体积大于2 mm时需要新生血管为其生长提供所需营养物质。由于促血管生成的通路在许多实体瘤的生长转移过程中发挥重要的作用，故促血管生成通路已被确立为实体瘤的重要治疗靶点[13-14]。肿瘤血管的新生在肿瘤的发生发展及浸润转移的过程中扮演着重要作用，涉及一个高度复杂的信号传导网络途径，包括肿瘤细胞的自分泌及周围基质细胞的旁分泌等。众多研究报道表明，乏氧是血管新生的关键因素[15-17]，可显著刺激促血管生成因子的表达。同时，乏氧也是影响放疗疗效的关键，以及放射治疗后肿瘤复发的重要因素[18-20]。放疗对促血管新生因子也具有影响作用，研究发现，肿瘤细胞接受不同剂量照射后，VEGF水平不同程度的升高，影响肿瘤血管新生，导致放疗耐受[21]。抗血管新生药物可改善肿瘤组织血管紊乱结构，使其接近正常血管的结构和功能，此为血管正常化理论。血管正常化后可改善肿瘤组织局部血供，降低其间质压力，提高氧分压，继而增强放疗敏感性[22]。研究发现，放疗结束后应用抗血管新生药物可显著降低肿瘤的局部复发率[41]，此机制可能与肿瘤血管正常化相关。现代鲜药作为肿瘤中医药治疗的特色，采用现代萃取工艺，最大限度地保留了其活性成分，以其独特的优势为我国鲜药广泛应用于临床提供了依据和保障。21世纪初，金龙胶囊以及金水鲜胶囊的研制为抗肿瘤治疗提供了新的选择。近年来已有大量临床试验证实抗血管新生治疗可改善放疗敏感性，提高放疗效果[23-24]。近年来研究发现，放射治疗肿瘤时联合中医中药治疗，不仅能减轻其副作用，而且具有抗肿瘤疗效[25]。但中医中药对肿瘤放疗增敏的作用机制缺乏相应的基础实验研究，尚未完全阐明。

在金水鲜联合放疗对肺腺癌A549细胞的增殖抑制试验中，结果表明，与NC组比较，各处理组细胞增殖均受到显著抑制作用，尤其是JSX+RT组细胞抑制率最高，明显高于其他处理组（P < 0.05），并且具有时间依赖性。推测金水鲜可能具有抑制肿瘤细胞增殖的能力。肿瘤细胞经放射线照射后，细胞中的遗传物质经放射性的直接作用，以及氧自由对遗传物质的间接作用，对细胞的正常周期具有阻滞作用，从而引起肿瘤细胞的增殖抑制以及细胞坏死。VEGF是肿瘤新生血管形成的最有效和特异的因子。临床研究表明肿瘤中VEGF的表达量与其血管密度密切相关，同时也与肿瘤恶性程度以及患者预后相关[26-27]。当肿瘤组织处于缺氧状态，其细胞相互连接为“拟态血管”，为肿瘤早期供氧。由VEGF介导的肿瘤新血管不同于正常血管[28]，其能增高肿瘤的转移概率。实验结果表明，金水鲜联合放疗可以显著抑制HIF-1α、VEGF蛋白及mRNA的表达。乏氧以及营养供应不足是实体肿瘤常见的主要特点。在实体瘤中，由迅速增殖的肿瘤细胞导致肿瘤中心区域供血不充分，从而发生缺血坏死。VEGF及其信号通路介导肿瘤组织中新生脉管的形成，其在肿瘤血管生成、重塑中发挥着重要作用。在缺氧环境下，肿瘤细胞亦处于乏氧状态，对射线的低能量线性传递产生抵抗，降低其对放射线的敏感性。HIF-1是乏氧的关键因子，研究表明，当HIF-1α复合物结合至VEGF启动子时，乏氧诱导VEGF的转录[21]。HIF-1在促进肿瘤血管新生中具有重要作用，在乏氧情况下，肿瘤细胞通过表达HIF-1调控其增殖及血管新生，从而促进肿瘤发展。也有研究证实放疗及化疗均促进HIF-1α的表达，进而促进多种促肿瘤生长因子的表达，如VEGF、bFGF、EGF等，刺激肿瘤血管新生[29]。有实验表明这些相关蛋白（如HIF-1α、VEGF等）不仅能诱导肿瘤细胞对放化疗的抵抗，而且增强肿瘤细胞的存活能力，抑制与之相关的蛋白，如HIF-1α，可使放疗增敏[30]。本研究中，各组细胞在不同处理方式处理24 h时，JSX+RT组与其他各组比较，HIF-1α和VEGF mRNA表达均有统计学差异（P < 0.05），表明金水鲜能够抑制肿瘤细胞分泌HIF-1α和VEGF；金水鲜与放疗联用对HIF-1α和VEGF的抑制作用更明显。因此推断金水鲜胶囊联合放疗可能下调HIF-1α及VEGF基因的表达，这可能是其放疗增敏作用的机制之一。

综上所述，通过金水鲜联合放疗可以抑制肿瘤细胞增殖及VEGF、HIF-1α的表达，其机制可能与HIF-1α、VEGF表达的调控相关，从而抑制血管生成因子对肿瘤血管新生的促进作用得以实现。然而本研究仅为体外实验，条件单一，所得结论尚需进一步验证，有待后续研究。

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（收稿日期：2016-04-11 本文编辑：张瑜杰）