基于蓝光技术的数字化分子诊断与检测技术

徐鹏涛,师茂林,张玲玲,张校亮,李晓春

(太原理工大学 物理与光电工程学院，新型传感器与智能控制教育部与山西省重点实验室，山西 太原 030024)



基于蓝光技术的数字化分子诊断与检测技术

徐鹏涛,师茂林,张玲玲,张校亮,李晓春*

(太原理工大学 物理与光电工程学院，新型传感器与智能控制教育部与山西省重点实验室，山西 太原 030024)

该文基于课题组前期对CD/DVD技术的生物光盘检测技术的研究基础上，建立了基于全新的BD技术的分子定量检测技术。与CD和DVD相比，BD光驱具有更小的激光聚焦光斑，实现了更高的检测通量与检测灵敏度。通过在蓝光光盘表面制备大小和灰度不同的墨点阵列，并利用标准BD光驱结合光盘质量诊断软件进行测试，分析了系统的横向分辨率以及用于定量检测的可行性，结果表明蓝光检测系统具有较高的灵敏度和横向分辨率(<100 μm)。在BD光盘表面成功制备了生物素—链霉亲和素结合反应阵列，利用标准BD光驱以及纠错软件，实现了对链霉亲和素的定量检测。

蓝光光驱/光盘；质量诊断；灵敏度；即时检测

传统的生物分子诊断方法存在耗时长、成本昂贵、操作复杂等缺点，因此，许多研究集中于开发面向普通用户的低成本即时检测(POC，Point of care)设备，如早早孕试纸条、比色卡、血糖仪等定性或定量的检测装置[1-2]。

利用常见的消费类电子设备如手机、扫描仪、数码相机等，使普通用户快速有效地实现分子诊断或有害物质检测，是近年来的研究热点[3-4]。计算机光驱/光碟播放机作为一款普及性较高的数字化读取设备，具有精密的光学读取机制和伺服控制系统，而普通光盘又可替代传统的硅片、玻璃片等作为生物分子反应的基底，在此基础上，国内外已有许多对利用光驱读取生物光盘的探索研究，并研发了不同的检测体系，从技术实现的角度，主要分为两类：通过对光驱硬件的改造以及本课题组提出的基于标准光驱/光盘的数字化分子检测技术。Lange 等[5]利用改装过的CD光驱激光探头实现了免疫检测反应的定量分析；Potyrailo等[6]直接从CD光驱的光电探测器提取模拟信号，实现了对金属离子的定量检测，Ramachandraiah等[7]在标准光驱上增加光电探测器，将光驱改装成激光扫描显微镜，对CD4+细胞进行成像，这类技术由于对光驱进行了改造，因此普通用户无法利用标准光驱进行检测。于化忠课题组在2008年提出了基于标准光驱/光盘技术的数字化分子检测技术[8-10]，该方法借助于CD光盘数据保护机制，利用CD标准光驱结合光盘质量诊断软件实现定量检测。在此基础上，本课题组将这一基于标准光驱/光盘的数字化分子检测技术从CD系统发展到DVD系统[11]，并实现了孕酮hCG[12]、毒品吗啡和可卡因[13]以及重金属离子[14]的高灵敏度定量检测。

随着存储需求的增加，光盘技术已由DVD迅速发展到BD(Blu-ray disc)。与DVD技术相比，BD采用更短的激光波长和更高的数值孔径，使聚焦光斑尺寸大大缩小，记录密度增加[15]。对基于光驱的检测技术而言，更小的光斑意味着更高的检测通量和灵敏度，基于此，本文研究了基于BD技术的数字化分子检测方案，利用BD表面内酯的水解反应，成功地将惰性BD转化为有活性的生物基底，并用标准蓝光光驱结合光盘质量诊断软件，实现了BD表面生物素—链霉亲和素反应的定量检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

紫外臭氧清洗机(PSD-UV，美国Novascan Technologies公司)，超纯水系统(Genpure UV，美国Thermo公司)，电子天平(美国Ohaus公司)，微量移液枪(瑞士梅特勒公司)，蓝光一次性写入盘(25GB BD-R，日本威宝公司)，蓝光刻录机(PX-LB950UE，日本浦科特公司)。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2-吗啉乙磺酸(MES)、吐温20、明胶(美国Sigma-Aldrich公司)；氯化钠、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、牛血清蛋白(BSA)、氢氧化钠(美国Aladdin公司)；叠氮化钠(NaN3，北京索莱宝科技有限公司)；氨基修饰的生物素(EZ-link@Amine-PEG2-biotin，美国Thermo Scientific公司)；纳米金-链霉亲和素结合物(Nanogold-streptavidin conjugate)、银染试剂盒(美国Nanoprobes公司)。实验用水为超纯水(18.20 MΩ·cm)。

1.2 实验方法

1.2.1 墨点阵列的制备与读取 使用蓝光刻录机和Blu-ray Disc Suite刻录软件(讯连科技有限公司)将高清格式的电影(22GB)刻录到光盘上。利用带有前置托盘的喷墨打印机(R270，日本爱普生有限公司)将墨点阵列打印在光盘表面，配套的Print CD用来设计打印样式和控制打印过程，本文设计了两种类型的墨点阵列：第一种为大小不一、灰度一致的墨点阵列；第二种为大小一致、灰度不同的墨点阵列。利用标准光驱结合光盘质量诊断软件PlexUtilities(v 1.3.3，http://plextoramericas.com)对光盘进行读取，速度为4X。

1.2.2 生物素—链霉亲和素反应阵列的制备与读取 首先将BD表面浸泡在0.1 mol/L的NaOH溶液中，温度为(55±1) ℃，水解90 min，用水彻底冲洗光盘表面并用氮气吹干，然后将光盘浸泡在活化液(100 mmol/L EDC，25 mmol/L NHS，溶剂为pH 5.8的MES缓冲液)中，活化4 h。在光盘表面覆盖聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流体通道板，将生物素溶液注入微通道中，固定8 h后，将缓冲液(pH 7.4，所含成分为150 mmol/L NaCl，0.8% BSA，0.1% gelatin，0.05% Tween 20，0.05% NaN3)注入通道，封闭2 h，随后将不同浓度的纳米金-链霉亲和素结合物依次注入不同的通道中，静置1 h，用银染液(48 mmol/L乙酸银和182 mmol/L对苯二酚)对反应区域银染5 min，彻底冲洗光盘并用氮气吹干后，对光盘进行读取，读取过程与“1.2.1”方法相同。

图1 蓝光系统纠错块示意图Fig.1 Schematic representation of the error correction code(ECC) block in a Blu-ray system

2 结果与讨论

2.1 BD质量诊断原理

BD系统以纠错块的形式对数据进行保护。图1是一个纠错块的示意图，白色部分代表用户数据，容量为64 kB；蓝色部分代表用户数据的校验码；其余4列称为警哨列。用户数据受到长距码(Long Distance Code，LDC)的保护，长距码由304个LDC码字组成，这些码字按照2×2的方式进行排列，形成一个496行×152列的矩阵块；纠错块最左侧的一列由同步位形式构成，其余3列由地址信息、控制信息及其校验码组成，地址信息、控制信息受到突发指示子码(Burst Indicating Subcode，BIS)的保护，突发指示子码由24个BIS码字构成，BIS码字经过交错交叉，形成一个496行×3列的矩阵块，由于BIS列和同步位列均可以指示长度不小于40字节的突发错误的位置，因此统称为警哨列。对于蓝光系统而言，纠错块是基本的数据质量测试单元，光盘质量诊断软件有两个测试参数：LDC和BIS，其中LDC代表每个纠错块中LDC码字发生校验错误的个数，BIS代表每个纠错块中BIS码字发生校验错误的个数。

2.2 墨点阵列的分析

为了研究蓝光检测系统的横向分辨率，首先对第一种墨点阵列进行测试。如图2所示，在光盘表面打印4组直径分别为0.1，0.2，0.3，0.4 mm的墨点；在LDC和BIS模式下均出现8个明显的检测信号，且随着墨点直径的增加，检测信号的幅值和宽度均增加，并且LDC模式下的信号强度是BIS模式下的50倍之多，这是由于LDC码字中用户数据占码字总容量的87%，对于表面物质会更加敏感，因此本文选用LDC作为检测参数。由实验结果得知，蓝光检测系统的横向分辨率在100 μm以下，远优于DVD系统[11-12]。

图3 光盘表面墨点的逻辑位置与物理位置的关系图Fig.3 Relationship between radial distance and logical position of the ink-spots on a BD

由于检测结果横坐标是光盘的逻辑位置，而在多样品的测试中，样品的物理位置更易于观察，基于存储容量正比于存储面积这一原理(存储密度不变)，可获得光盘物理位置与逻辑位置转换关系式：

在上述实验基础上，为了验证蓝光系统作为生物化学分子定量检测系统的可行性，进一步对第二种类型即尺寸一致但灰度不同的墨点阵列进行检测与分析，如图4A所示，随着墨点颜色的加深，信号幅值增加，而宽度(1.4±0.1) mm保持不变。随后比较了墨点引起的光学灰度比(ODR，Optical darkness ratio)与LDC 密度(单位面积内的LDC个数)的关系。传统的ODR检测方法的表达式为[16]：ODR=(Ib-Is)/Ib，式中，Ib代表背景的灰度，Is代表反应阵列的灰度。如图4B所示，当ODR从0.14增至0.23时，错误数密度增加较快，当ODR从0.23增至0.52时，错误数密度增加较慢，与DVD系统观察到的线性关系不同[11-13]。这是由于蓝光检测系统的纠错模式更加灵敏[15]，所以当墨点颜色在较浅范围内变化时，激光光强的变化导致 LDC变化较快，而当墨点颜色在较深范围内变化时，大部分激光被吸收，使得LDC变化较慢。

2.3 BD系统对生物素——链霉亲和素反应的定量检测及其与DVD系统的比较

链霉亲和素又称抗生物素蛋白，因其和生物素之间有着很强的非共价作用(Ka≈1015mol-1·L)，所以生物素——亲和素反应系统在生物分子检测中常被作为模型诊断工具[8-9,11]。图5顶部插图为经过银染后的生物光盘的光学图片，从光盘外圈到内圈，图中标号1～7的条带浓度分别为0.0，0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 μg/mL。从图5可以看出，随着链霉亲和素浓度的增加，银染条带亮度逐渐增强。图5A为生物光盘在LDC模式下的检测结果，随着链霉亲和素浓度的升高，检测信号的幅值迅速增强，当浓度增至0.8 μg/mL时，检测信号达到饱和。图5B中实线为LDC 密度随链霉亲和素浓度变化的关系，可以看出随着浓度的上升，LDC密度迅速增加，当浓度达到0.8 μg/mL后，LDC密度趋于饱和。

进一步考察了PIF(DVD系统中的纠错参数)密度与分析物浓度的关系，结果如图5B所示，随着分析物浓度的增加，PIF 密度的增长速度比LDC密度缓慢，直至分析物浓度达1.0 μg/mL时，PIF 密度才趋于饱和。由结果可知，BD系统可检测到的链霉亲和素的最低浓度小于0.1 μg/mL，比DVD系统的检出限(0.2～0.4 μg/mL)更低，且检测灵敏度高于DVD系统，但随着分析物浓度的增加，BD系统的检测信号更易达到饱和。

相较于DVD系统，BD系统能够实现低检出限和高灵敏度的主要原因有：①由于BD系统采用比DVD系统更短波长的蓝色激光(405 nm)和更高数值孔径的物镜，使得光驱在读取BD光盘时其表面光斑面积只有读取DVD光盘时表面光斑面积的1/14，所以低浓度的银染条带会对BD系统的检测光斑产生更大的消光作用(例如散射和吸收等)，使BD更易产生校验错误；②由于BD的存储密度(25 GB)是DVD(4.7 GB)的5倍之多，所以同样大小的银染条带覆盖的BD字节数更多；③蓝光检测系统的纠错模式更加灵敏。

3 结 论

本文提出了基于蓝光技术的数字化分子检测方案，通过对光盘表面微尺度墨点阵列的分析，表明了蓝光检测系统的横向分辨率小于蓝光光盘表面的光斑直径(138 μm)，可以检测出直径小于100 μm的墨点；通过对生物素——链霉亲和素结合反应的分析，得出相较于DVD系统，BD系统能够取得较低的检出限和较高的灵敏度，这是由于其采用了更短波长的蓝色激光和更高数值孔径的目镜以及BD存储密度的大幅提升和更加灵敏的蓝光检测系统纠错模式，使其可以成为应用于现场分析的低成本即时检测工具。

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Digitized Molecular Detection Based on Blu-ray Technology

XU Peng-tao，SHI Mao-lin，ZHANG Ling-ling，ZHANG Xiao-liang，LI Xiao-chun*

(Key Laboratory of Advanced Transducers and Intelligent Control System(Ministry of Education and Shanxi Province)，College of Physics and Optoelectronics，Taiyuan University of Tecnnology，Taiyuan 030024，China)

The rapid quantitative detection of biochemical molecule has the advantages of simple handling，rapid detection and easy on-site analysis，thus it has a widespread application prospect in many fields such as medical diagnosis，food safety and environment monitoring.Molecular detection technology based on optical disc and optical drive can be used as the next generation molecular diagnostic tool.In this paper，a bran-new quantitative detection of molecule based on bio-disc(BD) was proposed and studied around our previous research on BD detection based on CD/DVD technology.Compared with CD and DVD，Blu-ray drive has a smaller focus laser size，which means higher detection throughput and sensitivity.The quantitation capability and the lateral resolution of this system were evaluated by preparing ink-spot arrays with different sizes and darkness on the surface of BDs which were subsequently examined with a standard Blu-ray drive in conjunction with disc quality check software，and the Blu-ray detection system exhibits the higher sensitivity and lateral resolution(<100 μm).In the end，biotin-streptavidin binding assay was successfully prepared on the surface of BDs，and the quantitative detection of streptavidin was achieved by a standard Blu-ray drive in conjunction with disc quality check software.

Blu-ray drive/disc；quality check；sensitivity；point of care

2016-03-10；

2016-07-10

国家自然科学基金项目(61174010，21505098，21575098)；山西省国际合作项目(2015081019);山西省平台基地和人才专项 优秀人才科技创新项目(201605D211033)；山西省高等学校科技创新项目(2015123)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.015

O656.3;Q563.7

A

1004-4957(2016)12-1601-05

*通讯作者：李晓春，博士，教授，研究方向：光电分子检测技术，Tel:0351-3176638，E-mail:lixiaochun@tyut.edu.cn