六月青多糖对S180肉瘤细胞增殖的影响及机制

汤小军，黄仁彬，卢庭婷，黄建春

(1广西卫生职业技术学院，南宁530021；2 广西医科大学)

六月青多糖对S180肉瘤细胞增殖的影响及机制

汤小军1，黄仁彬2，卢庭婷1，黄建春2

(1广西卫生职业技术学院，南宁530021；2 广西医科大学)

目的 探讨六月青多糖对S180肉瘤细胞增殖的影响及其作用机制。方法 取SPF级昆明种小鼠48只，腹腔注射S180肉瘤细胞株，注射第8天时抽取腹水，分离细胞接种到96孔培养板；随机分为对照组、六月青多糖组。六月青多糖组加入适量六月青多糖，使其终浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125 g/L；对照组加入等量生理盐水。分别于培养24、48、72 h时采用MTT法检测各孔光密度(OD)值，计算细胞增殖抑制率。另取小鼠36只腹腔注射S180肉瘤细胞株，7 天后抽取腹水，分离癌细胞，将癌细胞悬液分别接种于小鼠右侧腋窝皮下，接种第11天时处死荷瘤小鼠，抽取腹腔积液并取脾脏，分离培养腹腔巨噬细胞及脾淋巴细胞，随机分为两组。六月青多糖组分别加入终浓度为200、100、50 μg/mL的六月青多糖；对照组加入等量生理盐水；培养24 h时采用ELISA试剂盒检测腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6水平及脾淋巴细胞IL-2、IFN-γ水平。结果 同时间点六月青多糖组细胞增殖抑制率随浓度增加而升高(P均<0.05)，同浓度下六月青多糖组细胞增殖抑制率随作用时间延长而升高(P均<0.05)。与对照组比较，200、100、50 μg/mL六月青多糖组腹腔巨噬细胞TNF-α水平逐渐降低(P<0.05或<0.01)；与对照组比较，100、200 μg/mL六月青多糖组腹腔巨噬细胞IL-6水平均增加，脾淋巴细胞IL-2、IFN-γ水平均增加(P<0.05或<0.01)。结论 六月青多糖体外对S180细胞增殖具有抑制作用，其机制可能为促进腹腔巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和脾淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ。

肉瘤；六月青多糖；腹腔巨噬细胞；脾淋巴细胞；炎症因子

广西民间草药六月青是爵床科植物肖鸡笼(顶头马兰)的地上干燥部分，六月青多糖是其主要成分。体内研究发现，六月青多糖能抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长，增强免疫功能、抑制炎症反应、促进细胞凋亡可能是其作用机制[1,2]。但六月青多糖在体外对S180肉瘤细胞的作用及其机制未见报道。2014年6月～2015年8月，本研究观察了六月青多糖在体外对S180肉瘤细胞增殖的影响，现分析结果，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠肉瘤细胞株S180购自广西中医药研究院。SPF级昆明种小鼠120只，体质量(20.0±2.0)g，购自广西医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证：SCXK(桂)2009-0002，实验动物使用许可证：SYXK(桂)2009-0004。六月青多糖由广西医科大学药学院提供，纯度为99%；RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；小鼠TNF-α、IL-6、IL-2和IFN-γ ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 六月青多糖干预及细胞增殖抑制率检测 取小鼠48只，均腹腔注射S180肉瘤细胞株，注射第8天时抽取腹水，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS液和RPMI 1640培养液各洗两次。调整细胞密度为1×108个/L，接种到96孔培养板，180 μL/孔。随机分为两组，六月青多糖组分别加入适量六月青多糖，使其终浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125 g/L(20 μL/孔)；对照组加入等量生理盐水。各组均置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，分别于培养24、48、72 h时每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，继续培养4 h，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，分别加入200 μL DMSO，振荡10 min，检测492 nm处各孔光密度(OD)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)[3]=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.2 六月青多糖干预及腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6检测 取小鼠36只，腹腔注射S180肉瘤细胞株，7 天后抽取腹水，用生理盐水调整细胞密度为1×1010个/L，将癌细胞悬液分别接种于另外36只小鼠右侧腋窝皮下，0.2 mL/只。接种第11天时处死，向其腹腔注入4 ℃的RPMI 1640培养液5 mL，揉腹部1 min后抽取腹腔积液，1 500 r/min离心5 min；RPMI 1640培养液调整细胞密度为1×1010个/L，接种至96孔培养板，100 μL/孔；37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h，弃上清液，PBS洗3次，弃非黏附细胞；在贴壁的细胞中加入RPMI 1640培养液100 μL/孔，经倒置相差显微镜观察和HE染色观察贴壁细胞为巨噬细胞[4]。随机分为两组，六月青多糖组分别加入适量六月青多糖，使其终浓度为200、100、50 μg/mL；对照组加入等量生理盐水。两组均置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，培养24 h时于4 ℃条件下1 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用ELISA试剂盒检测腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6水平，步骤均参照试剂盒说明书。

1.2.3 六月青多糖干预及脾淋巴细胞IL-2、IFN-γ检测 取1.2.2中处死的S180荷瘤小鼠，无菌条件下取脾脏，用D-Hank′s液洗后剪碎，过200目筛，1 500 r/min离心10 min，沉淀液中加入2 mL D-Hank′s液，用小鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用RPMI 1640培养液调整细胞密度为5×106个/mL[5]，台盼蓝检测细胞活力>95%。随机分组，分组方法及处理同1.2.2，各组均置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，培养24 h时于4 ℃条件下1 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用ELISA试剂盒检测脾淋巴细胞IL-2、IFN-γ水平，步骤均参照试剂盒说明书。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 同时间点六月青多糖组细胞增殖抑制率随浓度增加而升高(P均<0.05)，同浓度下六月青多糖组细胞增殖抑制率随作用时间延长而升高(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率

2.2 各组腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6水平和脾淋巴细胞IL-2、IFN-γ水平比较 与对照组比较，六月青多糖组各剂量作用后腹腔巨噬细胞TNF-α水平均升高(P<0.05或<0.01)。与50 μg/mL六月青多糖组比较，100、200 μg/mL六月青多糖组腹腔巨噬细胞TNF-α水平均升高(P均<0.05)，200 μg/mL六月青多糖组腹腔巨噬细胞IL-6水平升高、脾淋巴细胞IFN-γ水平升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6水平和脾淋巴细胞IL-2、IFN-γ水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05，#P<0.01；与50 μg/mL六月青多糖组比较，△P<0.05。

3 讨论

目前肿瘤治疗主要采用化疗、放疗、手术和生物治疗等综合措施，临床应用最广泛的抗肿瘤西药有金属铂类、抗代谢类、烷化剂等，但均具有干扰免疫系统、血液系统、消化系统等毒副作用。与抗肿瘤西药相比，中草药抗肿瘤治疗具有多层次、多通路、多目标、多成分的特点，我国已对药用植物中28个科(属)3 000多种药用植物进行了抗肿瘤作用筛选，发现200多种植物中含有抗肿瘤活性成分，主要包括蛋白质类、多糖类、蟾蜍甾二烯类、萜类、黄酮类、生物碱类、苷类等[6～9]。中药中的多糖成分是目前抗肿瘤药物研究的热点，其抗肿瘤作用显著且毒副作用小。多糖成分抗肿瘤的主要机制为：①中药多糖通过激活T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等细胞信号通路，促进细胞因子和抗体生成，发挥免疫调节作用[10]；②通过影响肿瘤细胞的生长、分裂、增殖等多个环节实现对肿瘤生长的抑制。目前，灵芝、人参、香菇、银耳、芦荟等中药(主要成分均为多糖)作为抗肿瘤药物或辅助药物已经广泛应用于临床[11,12]。

《本草拾遗》记载，六月青能凉血、活血、疏肝利湿、消肿止痛，主要用于急慢性肝炎、黄疸、高血压等治疗。前期研究发现，六月青的主要活性成分是六月青多糖和皂苷，两种成分均能抑制乙肝病毒的复制、保护肝细胞，对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化均有预防和治疗作用。此外，六月青石油醚部位和60%乙醇部位均能抑制胃癌细胞SGC7901、MGC803和乳腺癌细胞MDA-MB-231、口腔表皮样癌细胞KB的生长，对小鼠免疫功能有明显的增强作用[13]；六月青多糖可通过增强机体免疫功能、调节肿瘤细胞Bax和Bcl-2基因表达，进而抑制小鼠S180肿瘤生长[1,2]。本研究进一步发现，0.125、0.25、0.5、1、2、4 g/L六月青多糖作用24、48、72 h均可抑制S180细胞增殖，且具有浓度和时间依赖性。

肿瘤发生的原因之一是患者免疫系统功能低下导致免疫监视无能，肿瘤患者的免疫功能由早期的活跃状态演变为中后期的抑制状态，免疫状态与病情呈负相关，因此肿瘤的治疗措施之一是调节机体免疫功能[14]。机体免疫应答主要有细胞免疫应答和体液免疫应答，其中细胞免疫应答在抗肿瘤免疫中发挥关键作用，参与抗肿瘤细胞免疫的细胞主要有T淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞等，这些细胞被激活后通过分泌细胞因子发挥抗肿瘤作用，如激活的T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，增强细胞毒性T淋巴细胞的效应；活化的巨噬细胞释放TNF-α、IL-6等细胞因子，激活B淋巴细胞产生抗体，促进T淋巴细胞、NK细胞的抗肿瘤效应[15～17]。本研究结果显示，100、200 μg/mL六月青多糖均可促进S180荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和脾淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ，提示六月青多糖可能通过刺激巨噬细胞、淋巴细胞产生一系列细胞因子从而发挥抗肿瘤作用。

综上所述，六月青多糖可抑制体外S180肉瘤细胞增殖，刺激巨噬细胞、淋巴细胞产生TNF-α、IL-6、IL-2、IFN-γ可能是其作用机制，但其调节免疫细胞信号转导通路的具体机制有待进一步探讨。

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国家自然科学基金资助项目(81560587)；广西教育厅高校科学研究项目(2013YB343)。

黄建春(E-mail: huangjianchun008@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.009

R730.52

A

1002-266X(2016)44-0030-03

2016-01-04)