麦谷蛋白源外啡肽B5对肉鸡免疫功能的影响

郭伟

（南京市江宁区林业局，江苏南京211100）

麦谷蛋白源外啡肽B5对肉鸡免疫功能的影响

郭伟

（南京市江宁区林业局，江苏南京211100）

麦谷蛋白源GE-B5来源于日常人类饮食中的主要粮食产品小麦的蛋白酶解产物，具有阿片样的生物学特性，目前已经发现其有调节激素分泌进程，进而调节内分泌系统；延缓哺乳动物胃排空，抑制其肠道运动；具有一定的免疫反应性等功能。麦谷蛋白源GE-B5属于阿片样物质中免疫反应性最强的一种外啡肽。试验根据麦谷蛋白源GE-B5氨基酸结构，采用人工合成的方式，优化工艺制得高纯度的麦谷蛋白源GE-B5；将制得的GE-B5添加到传染性支气管炎灭活疫苗中作用于肉仔鸡，通过对鸡淋巴细胞增殖测定及鸡血清中抗体效价的检测，以判定麦谷蛋白源GE-B5的免疫效果。结果表明，人工合成的麦谷蛋白源GE-B5纯度高、成本低，一定浓度的GE-B5可明显促进鸡外周血淋巴细胞增殖和血清抗体水平。因此，麦谷蛋白源GE-B5具有一定的免疫增强作用。

麦谷蛋白；外啡肽B5；免疫功能

麦谷蛋白的谷类食品是存在于人类日常饮食中的主要粮食产品，包括小麦、大麦及黑麦。谷蛋白摄入量与麸质过敏症及失调症（如糖尿病、抑郁症和精神分裂症）紧密相关[1]。然而，迄今为止，关于谷蛋白摄入可能对人体产生有毒的影响意见还不一致，因为麸质过敏症患者往往没有明显症状。面筋是包含麦谷蛋白和麸朊的主要结构蛋白复合物。麦谷蛋白是独特的蛋白质类高分子聚合物，且为小麦蛋白质的小部分，可溶于稀酸溶液。谷粒中乙醇可溶性蛋白质被称为醇溶谷蛋白，在小麦中的醇溶谷蛋白即被特称为麸朊。麸朊能进一步促进阿片样物质的多肽（外啡肽）在消化道集为一体。在哺乳类动物日常的主要粮食产品中，存在一些特殊蛋白质，该类特殊蛋白质隐藏含有一些特殊的肽质（能够被消化酶作用分解释放，且能够参与内分泌协调的特殊肽）[2]。经研究证明，该类谷类食品特殊蛋白质中隐藏含有的特殊肽即为阿片肽。

在哺乳类动物激素分泌进程中，阿片样物质和生长素激素抑制素系统是用于调整细胞增殖扩散的2种主要调节系统。其中，阿片样物质对肠道运动的影响极为显著。胃排空和肠道运动受阿片样物质内因性和外因性的影响。吗啡因能延长人类胃肠道运动时间而闻名，但其作用能被纳洛酮（一种吗啡拮抗药）所消除[3]。早期研究表明，麦谷蛋白外啡肽能诱导胃肠道通过时间大大增加，当吗啡拮抗药作用时，该效果被彻底摧毁，最新研究结果不断验证了科学家的早期发现。目前，麦谷蛋白外啡肽能延缓胃排空、抑制肠道运动的作用已广为大家所接受。

阿片样物质的免疫反应性在人类肿瘤形成过程首次由Lundberg等证明，抗血清、阿片样物质的特效药（由兔培养）像脑啡肽一样具有免疫反应性。在1987年，Zagon等[4]研究发现，阿片样肽类存在于人和动物肿瘤神经系统和非神经组织中；肿瘤被发现起源于外胚层、中胚层和内胚层，既有恶性的也有良性的；该研究认为，阿片样物质是大部分肿瘤细胞的整体部件。阿片肽是一类具有免疫反应性、能够调节内分泌系统、延缓胃排空、抑制肠道运动的阿片样物质。其分为外源性阿片肽（外啡肽）和内源性阿片肽（内啡肽）[5]。其中，外啡肽又根据其组织结构分为5大类，本试验研究的外啡肽B5为其中较为重要的一类。对于阿片样物质免疫反应性这一特性，外啡肽B5效果最为显著。

本试验拟将麦谷蛋白源GE-B5与传染性支气管炎灭活疫苗混合作用于肉仔鸡，通过检测肉鸡的免疫性能，从而为GE-B5的进一步使用提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物和抗原传染性支气管炎病毒毒株

传染性支气管炎病毒非免疫肉仔鸡（180只、1日龄）（泰安东岳种禽有限公司）；疫苗抗原传染性支气管炎病毒（IBV）IBVM41（试验用）（江苏省生物教学示范中心）；SPF鸡胚（上海拜力生物科技有限公司）。

1.1.2 试验试剂淋巴细胞分离液（美国BECKMAN COULTER有限公司）；RPMI1640固体粉状培养基（上海创赛科技有限公司），配制培养基基本步骤：先采用超纯水配制；再加入青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL；再加入细胞培养生长液，采用浓度为10%的小牛血清（郑州九龙生物制品有限公司）实现；5 mg/mL的四甲基偶氮唑蓝溶液和1 mg/mL的ConA溶液（Spectrum公司）（过滤采用0.22 μm的混合纤维素酯滤膜）；DEPC水（Amresco公司）；乙醇、氯仿、异丙醇和二甲亚砜等均为分析纯。

1.1.3 外啡肽B5的人工合成根据其氨基酸的一级结构特点，以优化化学合成工艺为准则，采用小肽固相合成法进行化学合成，具体操作流程及步骤由青岛沃生生物科技有限公司加工合成，其合成路线如图1所示。

对加工所得产物进行质谱鉴定（先经高效液相色谱分析及纯化），结果证明，所得产物为高纯度的目标产物，将其冷冻保存备用。

1.2 方法

1.2.1 传染性支气管炎病毒抗原制备及残留毒素检测选取SPF鸡胚（9～10日龄），将其培养1代，获得疫苗抗原IBVM41株（试验用）。按照一般方法用0.1%的甲醛处理新获得的IBV M41鸡胚尿囊液（每0.1 mL≥106EID50），灭活24 h，将处理后得到的鸡胚尿囊液作为疫苗抗原，放于冰箱冷藏保存（4℃）备用。为鸡胚（9～10日龄）接种按照上述方法制备的灭活病毒，每枚鸡胚接种0.1 mL，在37℃环境下培养，培养3代后，观察记录受接种鸡胚情况；取存活鸡胚尿囊液测定活胚尿囊液病毒血凝效价，进行残留毒素检测。

1.2.2 灭活疫苗制备其制备过程如表1所示。

表1 灭活疫苗制备过程

1.2.3 灭活疫苗成品质量检测将1.2.1灭活疫苗成品接种在普通琼脂板和血平板2种平板上进行检验。在37℃的环境下培养5 d，观察记录2种平板上有无细菌生成。试验组是对每只肉仔鸡（14日龄）注射上述灭活疫苗成品1 mL。对照组是对每只肉仔鸡（14日龄）注射灭菌生理盐水1 mL。接种灭活疫苗成品及灭菌生理盐水后记录观察14 d（主要观察精神状态及有无不良症状[7]）。

1.2.4 试验动物处理传染性支气管炎病毒非免疫雏鸡（180只种禽）随机分为6组（每组为30只，试验组为1～5组，对照组为第6组），笼养，自由采食饮水。其中，试验组于14，21 d时均采用灭活疫苗（0.1 mL/只，105EID50/0.1 mL）注射，诱发肉仔鸡产生免疫反应。对照组是不对肉仔鸡进行任何处理。

1.2.5 鸡淋巴细胞（PBMC）增殖试验

1.2.5.1 鸡外周血淋巴细胞的制备从鸡的外周血中分离培养淋巴细胞，对肉仔鸡第1次注射灭活疫苗成品后14，21 d时，分别从鸡翅静脉处取1 mL外周血（无菌操作）；后将外周血缓缓沿侧壁加入已含有淋巴细胞分离液4 mL的离心管中，将外周血加入分离液的液面上。对玻璃离心管进行离心，以2 000 r/min的速度，离心15 min。离心后得到上下2层，采集上下2层界面上的细胞（肉眼观察呈白色雾状）；将采集到的界面细胞加入新的离心管中，且用PBS缓冲液加入界面细胞溶液至8 mL，手动摇匀，以2 000 r/min对新离心管离心10 min，去除上层清液，对下层沉淀（界面细胞）用PBS缓冲液洗涤2次，得到的细胞即为鸡外周血淋巴细胞；用活细胞染色计数的方法，通过营养液调节，将鸡外周血淋巴细胞密度调至5×106个/mL。然后将鸡外周血淋巴细胞悬液加入细胞板中保存备用。

1.2.5.2 淋巴细胞增殖试验将1.1.3人工化学合成的终外啡肽B5质量浓度调至10，20，40，80 mg/L，将4种质量浓度的GE-B5加入到酶标孔中各100 μL，每种质量浓度做3次水平重复；阴性对照：100 μLRPMI-1640培养基加入PBS缓冲液，3次水平重复；阳性对照：100 μL RPMI-1640培养基加入氢氧化铝。所有孔均加入刀豆球蛋白A，3次水平重复；将酶标板置于37℃环境下培养44 h后，每酶标孔加入40 μL噻唑蓝，再置于37℃环境下继续培养4 h[8]。吸除孔中完全培养液，每酶标孔加入100 μL二甲基亚砜，手动振荡溶解沉淀。将酶标板置于酶标仪上，测定OD570的值，参照文献[9]计算刺激指数。

1.2.6 血清抗体效价检测测量抗体效价参考A-vian等2008年研究的OIE方法[10]进行。对肉仔鸡第1次注射灭活疫苗成品后14，21，28 d时，分别从鸡翅静脉处取血分离（无菌操作），按国标用微量检检测法测定血清效价。

2 结果与分析

2.1 人工合成外啡肽B5产物检测结果

由青岛沃生生物科技有限公司操作，采用小肽固相合成法进行化学合成，对加工所得产物进行质谱鉴定（先经高效液相色谱分析及纯化），结果证明，所得产物为高纯度的目标产物，达到试验所设想的预期目标，质谱鉴定测得分子量为594 Da（图2），高效液相色谱分析测得，其GE-B5产物浓度大于98%（图3）。

2.2 IBV抗原残留毒素检测及疫苗成品质量检测结果

将灭活疫苗成品通过接种平板和对灭活疫苗成品毒液进行离心2种方法，观察有无杂菌生成及有无离心分层，判定灭活疫苗成品质量。结果发现，本试验中制备的灭活疫苗没有菌落生长，且离心后没有分层。

2.3 GE-B5对鸡淋巴细胞增殖效果

试验采取的是MTT比色法[10]即噻唑蓝比色法检测细胞存活和生长情况。由图4、表2可知，试验组中质量浓度为20，40，80 mg/L的刺激指数（SI值）均比对照组高，且GE-B5质量浓度为20 mg/L时的刺激指数最高[6]。因此，外啡肽B5在质量浓度为20 mg/L时对鸡淋巴细胞增殖效果最好。

表2 鸡血清中IBV抗体效价测定结果log2

2.4 GE-B5对鸡血清抗体效价影响结果

从表2可以看出，使用GE-B5组的肉仔鸡的IBV抗体效价显著高于空白对照组，特别是试验2，3，4组更为显著。说明GE-B5可显著提高肉仔鸡的抗体效价，抗体效价是衡量机体抵抗病原能力的重要指标。

3 讨论

淋巴细胞是机体免疫应答功能的重要组成部分[11]。本试验通过测定肉鸡外周血中淋巴细胞的增殖评价麦谷蛋白源GE-B5有无免疫效果，结果显示，普通情况下，将传染性支气管炎病毒灭活疫苗注射到肉鸡体内，肉鸡的免疫应答较弱，产生的抗体水平较低[12]；在传染性支气管炎病毒灭活疫苗中加入氢氧化铝，肉鸡的免疫应答有所增强；在传染性支气管炎病毒灭活疫苗中加入不同质量浓度的麦谷蛋白GE-B5，肉鸡的免疫应答均有明显增强，且以质量浓度为20 mg/L的麦谷蛋白GE-B5的添加量效果最为显著。证明一定浓度麦谷蛋白GE-B5可以加入到灭活病毒疫苗中，制成灭活疫苗成品，以改善受体的免疫应答，增强抗体水平。

外啡肽是非常高效的物质，其极低浓度范围内就能发挥作用。尽管外啡肽的受体具有一定的特异性，但许多结构的变化还是在可识别范围内[13]，虽然结构的变化可能会伴随着效用的降低，但事实上，就算只有1%的外啡肽，依然会是有效的并且有较强的药理作用[14]。食物中的蛋白也有与之相类似但不完全相同的肽链序列，这是一种从外源性食物中得到的阿片样肽，这种肽就是本试验研究的外啡肽[15]。可以在胃蛋白酶分解的小麦蛋白中发现具有活性的外啡肽，这种蛋白常常作为治疗腹腔疾病的ARIMAR因子为人所知，并且被认为有可能是精神分裂症的病因[16]。

由于谷蛋白源的GE-B5具有非特异性，故其能被添加到多种病毒疫苗中混合制得灭活疫苗成品，且GE-B5相较于传统的氢氧化铝，其免疫增强作用更为明显。

4 结论

本研究结果表明，谷蛋白来源的GE-B5可采用人工合成方法制得，且得到的成品纯度较高，通过给肉鸡注射添加过谷蛋白来源的GE-B5的灭活疫苗成品，观察记录并测定鸡外周血的淋巴细胞的增殖，结果显示，与对照组相比，不同质量浓度的谷蛋白来源的GE-B5均可明显增强免疫应答；并通过对灭活疫苗注射后鸡血清抗体效价的测定，结果验证了谷蛋白来源的GE-B5的免疫增强作用。

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Effects of Gluten Exorphin-B5 on Immune Function of Broilers

GUOWei
（NanjingJiangningForestryAdministration，Nanjing211100，China）

Gluten exorphin B5 was derived fromthe main food in dailyhuman diet products the protease solution products ofwheat. Gluten exorphin B5 was the biological characteristics of opioid.Up to now,the biological characteristics such as regulating hormone secretion process,regulating the endocrine system,delaying mammals gastric emptying,holding the bowel movement,having certain immune reactivity had been found.Gluten exorphin B5 was the strongest immune reactivity in opioid.According to the source of glutenin GE-B5 amino acid structure,with the method of artificial synthesis,optimizing process for high source of Gluten exorphin B5 was done in this experiment.High source of Gluten exorphin B5 were added to IBV.Through the determination of lymphocyte proliferation,the immune effect of Gluten exorphin B5 was determined.The resules showed that chemically synthesized Gluten exorphin B5 had high purity and lowcost.Appropriate concentration ofGE-B5 could obviously promote the chicken peripheral PBMC proliferation.So,Gluten exorphin B5 has a certain immune enhancement effect.

gluten protein;Gluten exorphin B5;immunogenicity

S831.92

A

1002-2481（2016）12-1843-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.12.26

2016-08-01

郭伟（1981-），男，江苏南京人，助理畜牧师，主要从事动物疫病控制研究工作。