黑麦CenH3基因克隆及其在小麦1BL/1RS易位染色体中的定位

李亚莉，聂园军，杨 峰，孙 玉，董艳辉，任永康，唐朝晖

（1.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031；2.中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京100101；3.山西省农业科学院农业资源与经济研究所，山西太原030006；4.山西省农业科学院小麦研究所，山西临汾041000；5.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031）

黑麦CenH3基因克隆及其在小麦1BL/1RS易位染色体中的定位

李亚莉1，2，聂园军3，杨 峰4，孙 玉5，董艳辉1，任永康5，唐朝晖1

（1.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031；2.中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京100101；3.山西省农业科学院农业资源与经济研究所，山西太原030006；4.山西省农业科学院小麦研究所，山西临汾041000；5.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031）

黑麦属蕴藏着丰富的遗传变异和改良小麦品质的优良基因，将其导入小麦能够拓宽小麦的遗传基础、丰富小麦的遗传变异。研究采用分子克隆技术获得黑麦CenH3基因的部分片段，并进行探针标记；同时，利用基因组原位杂交技术，筛选出32份1BL/1RS易位系；应用FISH技术，检测筛选出的32份1BL/1RS易位系，所有1BL/1RS易位系材料中均未发现黑麦CenH3基因的信号。但是，应用小麦和黑麦特异着丝粒DNA序列进行FISH检测，2个信号均出现在所有被检测的1BL/1RS易位系材料中。说明1BL/1RS易位染色体在不同小麦背景和山羊草属背景中均能稳定遗传，1RS的着丝粒DNA序列对1BS的着丝粒DNA序列有很好的补偿性，与小麦CenH3蛋白相互作用指导易位染色体正确分离且稳定遗传。

黑麦；CenH3基因；荧光原位杂交；1BL/1RS易位系

在六倍体小麦的育种研究中，小麦的近缘种属是改良小麦品种的一个巨大基因库，将这些优良基因导入普通小麦，对小麦的遗传学研究和育种工作都具有重要的意义。黑麦属作为小麦的三级基因源，蕴藏着丰富的遗传变异和改良小麦品质的优良基因，育种学家通过创制附加系、代换系和易位系等育种材料，已成功地将黑麦的这些抗性和丰产性基因导入小麦中。其中，小麦-黑麦1BL/1RS易位系应用最为广泛，通过1RS易位到小麦染色体中，将其携带的Lr26，Sr31，Yr9，Pm8等抗病性、丰产性和适应性相关的基因导入到小麦品种中[1]，同时1RS在能够很好地补偿1BS缺失引起的负效应[2]，成为迄今为止世界范围内应用最成功的易位系[3]。但是，目前许多推广品种中，1RS臂上的抗性基因逐渐丧失抗性，且易位系携带的黑麦碱基因又导致小麦品质下降。因此，创制抗性和品质优良的小麦-黑麦新易位系是摆在小麦育种工作者面前的首要任务[4]。

植物着丝粒指染色体主缢痕处的特殊分化区域，主要由富含重复序列的异染色质组成。这些高度甲基化的DNA序列与蛋白质形成的着丝粒动粒蛋白复合体直接参与细胞分裂过程。因此，着丝粒对染色体遗传和基因组稳定具有重要作用[5]。在细胞有丝分裂和减数分裂过程中，着丝粒区特异的组蛋白H3变体（植物中称为CENH3，动物中称为CENPA）与动粒蛋白结合，在纺锤丝的牵引下正确移动至细胞两极。CenH3是较早发现的功能着丝粒的基本蛋白质，其与典型组蛋白H3的分子序列和蛋白结构差异较大，即使在亲缘关系密切的近缘种之间，尤其在N末端的长度和氨基酸组成方面存在显著差异[6-7]。CenH3蛋白不仅能导致细胞有丝分裂的紊乱，而且还和外源染色体在寄主基因组中的去留有着千丝万缕的联系，在大麦×球茎大麦[8]和小麦×玉米[9]研究中均发现，由于父本CenH3蛋白在合子中失活导致有丝分裂错误。除了这些着丝粒特异的组蛋白，还有另一类着丝粒DNA分子，这些DNA分子序列保守性很低，其类型和排列方式基本相似，一般由夹杂排列的卫星DNA串联重复阵列（tandemrepeat，R）和着丝粒专一的反转录转座子（centromereretrotransposons，CRs）构成。着丝粒DNA序列虽然功能上高度保守，但在序列水平上却高度不保守，这成为着丝粒研究中的一个未解之谜[10]。着丝粒反转录转座子能够定位包含CenH3的核小体的分布方式[11]，甚至在CenH3失活或者缺失时，染色体依然能正常分离[12]，推测着丝粒反转录转座子起主要作用，这种推测在随后关于Holocentricity的研究中得到证实，在动物和植物中都发现，部分物种中着丝粒缺失CenH3，但着丝粒还能正常行使其功能，正是由于密集分布的反转录转座子替代CenH3的功能协助染色体正确分离[13]。

本研究利用黑麦KingII和不同的小麦背景和山羊草属背景的1BL/1RS易位系为研究材料，克隆了黑麦的CenH3基因的部分片段，应用顺序荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）分析，发现在所检测的32份1BL/1RS易位系中，均未检测到黑麦的CenH3基因信号，但检测到黑麦的着丝粒特异重复序列，初步探讨该易位染色体不仅将黑麦的整臂易位过来，着丝粒区域也有黑麦的DNA序列，在易位染色体的正确分离中，小麦的CenH3可能起了重要的作用，这些分子和细胞学方面的实验结果可为进一步探讨该易位染色体在不同小麦背景中的稳定遗传机制提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料来自小麦1BL/1RS易位系亲935、晋春13等45份小麦细胞质的易位系，由山西省农业科学院作物科学研究所小麦室保存。小麦K型不育系豫麦3和豫麦21以及黑麦品种King II由中国科学院遗传研究所韩方普教授提供。

大肠杆菌DH5α，RT-PCR试剂盒，T1 DNA连接酶，PeasyT1载体，反转录试剂盒One-StepAMV RT-PCR Kit和DL 2000购自宝生物工程（大连）有限公司；通用型DNA纯化回收试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物合成和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。氯仿、无水乙醇、硼酸、琼脂糖、Tris碱、异丙醇等常规试剂采用国产分析纯或进口分装。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 植物总DNA的提取采用CTAB法[14]，利用微量紫外分光光度计检测样品DNA浓度，并统一稀释至终浓度为100ng/μL。

1.2.2 总RNA提取、cDNA第1链的合成、cDNA和gDNA序列扩增 黑麦材料盆栽，待苗长到第3片叶完全展开时取样，利用Tiangen公司RNA提取试剂盒，提取叶片总RNA，经检测RAN未降解，质量较高。然后，利用Tiangen公司的反转录酶进行反转录反应，获得第1条链cDNA，具体的操作流程按照说明书进行。根据近缘种CenH3保守结构域设计引物：

acting-F：GTTCCA ATCTATGAGGGATACACG C；acting-R：GAACCTCCACTGAGAACAACATTAC C；WC1-F：GCGCTGAAGGGGCAACTGGG；WC1-R：TGCACCCCCAATACATAAAACATCTCC；WG2-F：G CGACGACGGAGACGAAGAA；WG2-R：GAGCAAAGCAGGGAGGTCAG。

以反转录所得cDNA以及提取的gDNA为模板进行PCR扩增。扩增总体积为50.0μL，扩增体系为：cDNA 1.0～1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0μL，10×PCR buffer2.5μL，KOD-Plus聚合酶1.0～1.5μL，25mmol/L Mg2+2μL，dNTP（40mmol/L）0.5μL，PCR补足水50.0 μL。

反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，56～62℃退火1 min，68℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10min；10℃保温。

1.2.3 PCR产物回收纯化、T-载体克隆与阳性克隆筛选 在1%琼脂糖凝胶上进行检测可知，cDNA产物条带大小为500 bp左右，DNA产物条带大小为3 000 bp左右。将目的条带回收纯化后连接到PeasyT1载体上，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑选白色单菌落于涂布含有IPTG和X-gal的氨苄LB固体平板上扩大培养。对菌体进行PCR扩增，筛选阳性克隆。

1.2.4 序列测定与比较分析 将阳性克隆进行测序（生工生物工程（上海）股份有限公司完成）。序列分析利用GeneTool软件进行。

1.2.5 原位杂交 采用GISH和FISH方法对所有材料的根尖细胞中期染色体进行分析鉴定。挑选籽粒饱满的种子在垫有湿滤纸的培养皿中发芽，待根长长到2～3 cm时，剪取发芽种子的根尖。根尖细胞中期染色体的制备、探针标记方法以及原位杂交程序均按照Han等[15]描述的方法进行。GISH分析中，以中国春基因组DNA作为封阻，以黑麦基因组DNA利用地高辛（Digoxigenin-11-Dutp，DIG；Roche，Germany）缺口平移法标记探针。FISH鉴定以重复序列pAs1（标记为红色）、来自黑麦的重复序列pSc119.2[16-17]和黑麦基因组DNA（标记为绿色）为探针进行FISH分析筛选易位系；以来自黑麦着丝粒重复序列pAWRC.1[18]（标记为绿色）为探针检测易位染色体的着丝粒DNA序列组成。用细胞学镜检采用OLYMPUSBX60荧光显微镜观察，用PhotometricsSenSysCCD成像。

2 结果与分析

2.1 CenH3基因cDNA片段的获得和部分gDNA序列克隆

根据小麦CenH3基因保守区设计引物，以黑麦cDNA为模板，扩增出500 bp左右的条带，将PCR产物从1%的琼脂糖中回收纯化，再与PeasyT1载体连接，重组T载体转化感受态大肠杆菌DH5α菌株、培养基培养，将菌液进行PCR检测，将阳性克隆的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果表明，扩增获得的cDNA序列长度为537bp，将所得序列与NCBI中黑麦近缘种小麦、燕麦等进行同源比对，结果发现，与这些近缘种的CenH3基因在序列上相似度较高，可以确认该片段是黑麦CenH3基因的部分片段。结合小麦CenH3基因的序列，重新设计引物，采用同样的方法在黑麦基因组DNA中扩增出一条3 000 bp左右的片段，经测序去载体后，获得黑麦2 617 bp的序列。

2.2 细胞学筛查小麦 1BL/1RS易位染色体及1RS断裂点分析

着丝粒是真核生物染色体正确分离和传递所必需的染色体区域，在细胞有丝分裂和减数分裂过程中起重要作用。在远缘杂交、回交后代群体中可检测到自发产生的易位，这种自发产生的易位大多是由外源单价体着丝粒错分裂形成的整臂易位[19]。小麦1BL/1RS易位系是在全球应用最广泛的易位系，外源染色体在不同小麦背景中都能稳定遗传，为此，本试验检测1BL/1RS易位染色体着丝粒的组成。首先，采用GISH和顺序FISH的方法筛选1BL/1RS易位系，以重复序列pAsI和黑麦基因组DNA为探针进行GISH，FISH分析（图1）。

在159份材料中筛选出28份不同小麦背景的1BL/1RS易位系以及4份K型1BL/1RS不育系和保持系。这些1BL/1RS易位染色体无论在小麦背景中还是山羊草属背景中都能稳定遗传。其次，选取其中32份1BL/1RS易位系以重复序列pAs1和pSc119.2为探针进行 FISH分析，结果表明，1BL/1RS易位染色体的着丝粒区域出现2个信号，小麦和黑麦着丝粒DNA序列的信号均被检测到（图2）。

根据FISH检测结果，在本研究筛选到的32份1BL/1RS易位系材料中，继续用小麦着丝粒重复序列pAs1标记红色探针，黑麦特异着丝粒标记为绿色探针，可以看出，在易位染色体中黑麦特异的重复序列和小麦的着丝粒信号同时出现在易位染色体中。因此，对于着丝粒DNA序列而言，小麦和黑麦的特异着丝粒DNA序列同时出现在易位染色体的着丝粒区域，这些重复序列和CenH3蛋白相互作用，可能进一步参与指导1BL/1RS易位染色体的正确分离。

2.3 CenH3基因在1BL/1RS易位染色体中的定位

CenH3是发现较早的功能着丝粒的基本蛋白质。相关的CenH3蛋白研究中，基于蛋白质与DNA相互识别的机制，通常采用同源克隆、回收基因组DNA酶切片段和CENH3抗体进行染色质免疫沉淀（CHIP）实验，分离着丝粒DNA序列[20-22]。在小麦1BL/1RS易位系中，易位染色体在不同小麦背景中均能稳定遗传，该易位染色体的着丝粒起关键作用。为此，将小麦、燕麦、玉米和水稻等的CenH3进行同源比对，设计引物扩增黑麦CenH3基因的cDNA序列，然后根据小麦的CenH3基因组的DNA序列重新设计引物，以黑麦基因组DNA为模板扩增黑麦CenH3的DNA序列，获得约2.5 kb的序列，在对应的平板上重新挑菌过夜培养，提取质粒基因组DNA，标记探针（绿色），FISH检测其在1BL/1RS易位染色体上的位置，并未发现在1BL/1RS易位染色体上有黑麦CenH3基因的信号。

3 讨论与结论

着丝粒是植物染色体重要的标志性结构。通过细胞学的研究方法和技术，科学家很早就发现着丝粒和特异性的蛋白结合成动粒，在细胞有丝分裂和减数分裂中成为纺锤丝牵引附着的主要位点[23]。不同植物着丝粒区域大小不一，结构也较为复杂，主要由着丝粒DNA序列和蛋白结合区域组成[24]；着丝粒DNA序列是植物甚至真核生物进化最快的序列之一，即便在亲源关系非常接近的物种中，着丝粒的DNA序列长度或组成也可能完全不同，这些着丝粒DNA序列通常由高度串联重复的卫星序列和高拷贝数的反转录转座子组成[25-26]。CenH3是较早发现的功能着丝粒的基本蛋白质。即使在亲缘关系密切的近缘物种中，CenH3与组蛋白H3无论在组成还是结构上都有较大的差异，CenH3基因的序列也高度趋异且羧基端蛋白质折叠域的变异与核小体定位密切相关[27-28]。CenH3蛋白发生任何修饰或者突变都会导致染色体错分裂，致使产生非整倍体或者单倍体后代[29]。可见，着丝粒特异组蛋白和DNA序列之间的互作在染色体的分离过程中起关键作用。在小麦的育种改良中，育种学家通过附加系或者花粉辐射等方法创制各种易位系，但是在转育的过程中发现多数易位系不能稳定遗传，但是1BL/1RS易位系却能在不同的小麦背景中均稳定遗传，甚至在山羊草属的细胞质中也能稳定遗传，本研究通过克隆黑麦的CenH3基因约2.5 kb的序列，应用FISH的方法标记探针，1BL/1RS易位染色体在2种细胞质背景的小麦中都无法检测到信号，说明1BL/1RS易位染色体中黑麦的CenH3不表达或者发生基因沉默，只有小麦的CenH3在染色体分离过程中和着丝粒DNA序列互作，指导易位染色体正确分离。

然而，由于着丝粒结构特殊，特别是着丝粒包含高度重复序列和多拷贝的反转录转座子，导致构建测序所用的克隆重叠群难度较大；其次，着丝粒的功能在几乎所有的真核生物中都极为保守，但是他们的序列变化较大，即便在亲源关系很近的物种之间。因此，对着丝粒区域的DNA序列组成及其功能的解析，成为人们理解真核生物最后的边界[24]。1BL/1RS易位染色体不仅在小麦背景中能稳定遗传，在山羊草属背景中也能稳定遗传，易位染色体着丝粒区域在分离过程中起关键的作用，尽管在1BL/1RS易位染色体中检测到黑麦着丝粒DNA序列，但是小麦、黑麦着丝粒DNA序列的融合位点及黑麦着丝粒DNA序列的组成、长度及活性等方面是否发生变化，还需要结合CHIP技术做进一步的研究。其次，在一些模式植物的研究中发现，CenH3蛋白和外源染色体在寄主基因组中的去留有着千丝万缕的联系，在大麦×球茎大麦和小麦×玉米的研究中，均发现由于父本CenH3蛋白在合子中失活而逐渐丢失。小麦K型1BL/1RS易位系和保持系杂交会产生一定比例的单倍体[30]，但是在后代的筛查中没有发现错分裂，可能与黑麦的CenH3基因不表达有关，但小麦的CenH3蛋白和黑麦的部分着丝粒DNA序列之前的相互作用机制还有待进一步研究。因此，今后对易位染色体着丝粒序列进行进一步的CHIP分析，将有助于理解1BL/1RS易位染色体在不同小麦和山羊草属背景中均能稳定遗传的机制。

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Cloning of the CenH3 Gene in Rye and Its Location of 1BL/1RS Translocated Chromosome

LI Yali1，2，NIE Yuanjun3，YANG Feng4，SUNYu5，DONG Yanhui1，RENYongkang5，TANG Zhaohui1
（1.Reseach CenterofBiotechnololgy，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China：2.InstituteofGeneticsand Developmental Biology，Chinese Academy ofSciences，Beijing100101，China；3.InstituteofAgricultural Resources&Economy，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taiyuan 030006，China；4.Institute ofWheat，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Linfen 041000，China；5.Institute ofCrop Sciences，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Rye containg a lot of resistance genes is an important genetic resource for wheat improvement.Transferring valuable genesof rye（Secale cereale L.）into hexaploid wheat（Triticum aestivum L.）can widen the genetic constitution and enrich variation of wheat.Weobtained a partof CenH3 geneusing technologyofmolecular cloningand applied forDigoxigenin-labelled gDNA probesof the CenH3 gene.Meanwhile,including Ae.kotschyi cytoplasm of 1BL/1RS type,32 samples of different genetic background belong to 1BL/1RS translocation lines,and these 1BL/1RS translocation lineswere tested with genomic in situ hybridization（GISH）and fluorescent in situ hybridization（FISH）.The result showed that therewas no sigals of CenH3 gene of rye.However,two sigals from special tandem repeats of centromere of wheat and rye were found in all samples.So DNA sequence of centromere from 1RS was also considered as a compensatory substituteof 1BS,and the interaction of the CenH3 protein of wheat and DNA sequence of centromere of rye could lead to correctsegregation ofchromosomesand steadily hereditary in differentgenetic background.

rye;CenH3 gene;fluorescence in situ hybridization（FISH）;1BL/1RS translocation lines

S512.5

A

1002-2481（2016）07-0889-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.01

2016-05-08

国家科技支撑计划项目（2013BAD04B03-04）；山西省国际科技合作项目（2015081002）；山西省农业科学院博士基金项目（YBSJJ1413）

李亚莉（1978-），女，山西代县人，博士，主要从事小麦遗传育种研究工作。唐朝晖为通信作者。