安徽地区1 163例男性不育患者Y染色体无精子因子基因微缺失分析

刘文，何国平，宋雅娴，胡月，郭通航，张娱，张贤生

(1.安徽医科大学附属省立医院生殖中心，安徽 合肥 230001；2.安徽医科大学第一附属医院泌尿外科，安徽 合肥 230022)



安徽地区1 163例男性不育患者Y染色体无精子因子基因微缺失分析

刘文1，何国平1，宋雅娴1，胡月1，郭通航1，张娱1，张贤生2

(1.安徽医科大学附属省立医院生殖中心，安徽 合肥 230001；2.安徽医科大学第一附属医院泌尿外科，安徽 合肥 230022)

目的 通过分析安徽地区1 163例不育男性的Y染色体无精子因子(AZF)微缺失情况及特点，探讨其在诊治男性不育症中的临床价值。方法 采用多重聚合酶链式反应(mPCR)技术扩增1 163例精子数目、活力异常的男性不育患者AZF基因的15个序列标签位点(STS)，并使用琼脂糖凝胶电泳对目的片段进行鉴别分析。结果 1 163例不育患者中130例(11.18%)患者AZF基因位点发生微缺失。在AZF微缺失组合类型中，AZFc+AZFd位点微缺失最多，共97例(8.34%,97/1 163)；其次为AZFb+AZFc+AZFd的组合缺失，共21例(1.81%,21/1 163)；AZFa+AZFb+AZFc+AZFd四个AZF区域均发生缺失的患者，以及仅仅在AZFa区域发生微缺失的患者分别为6例，各占总不育患者的0.52%(6/1 163)。结论 Y染色体AZF区域微缺失是部分男性不育症的重要遗传致病因素，有必要对精液质量异常的男性不育患者进行AZF基因微缺失检测，将有助于明确病因并指导后续治疗。

男性不育；无精子症；少精子症；无精子因子；Y染色体微缺失

近年来，由男方不育引起的不孕比例已由15%增至50%[1]。男性不育的影响因素较多，包括性交异常、免疫学病因和内分泌因素等，其中由于遗传因素引起的不育占整个影响因素的30%，包括染色体异常及与生精相关基因的异常[2]。Klinefelter’s征和Y染色体长臂无精子因子(Azoospermia factor,AZF)微缺失是主要的遗传性不育因素[3]。AZFa、AZFb、AZFc、AZFd基因片段位于Yq11.23，包含了大量的插入重复片段和回文结构，因此易发生微缺失[4]。进一步可导致无精子症或严重的少弱精子症，约占无精子症或严重少弱精子症总数的10%～15%[5]。伴随着Y染色体DNA文库和覆盖Y染色体DNA序列标签位点(Sequence tag sites,STS)物理图谱的建立，对精子数目、质量异常的不育患者进行AZF微缺失检测已成为国内外男科、生殖医学中心、产前遗传咨询门诊的必备常规检查。目前已发现AZF区域有近300个STS位点标记，这种多位点标记为检测AZF缺失提供了有利的条件[6]。本研究总结了自2012年6月至2015年6月安徽地区1 163例男性不育患者进行染色体检查的结果。以患者的外周血基因组DNA为模板，采用多重聚合酶链式反应(PCR)技术扩增Y染色体AZF区域15个序列标签位点(STS)的目的片段并电泳分析，探讨AZF基因微缺失发生率及组合缺失类型，以期明确AZF微缺失与精子数量、质量异常及男性不育症发生的关联，为临床诊疗提供指导。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2012年6月至2015年6月在安徽医科大学附属省立医院生殖中心进行精液常规检测发现异常的1 163例男性不育患者，年龄23～45周岁。患者均无急性传染性疾病、无接触大剂量放射线、无接触有害生化物质和严重泌尿生殖道外伤史，同时排除急性睾丸炎、附睾炎、尿道炎等严重泌尿生殖道感染患者。

1.2 检测试剂 血液基因组DNA提取试剂盒由北京康为世纪生物科技有限公司提供(Cat.No.CW9008-20)，Y染色体AZF基因微缺失检测试剂盒由广东深圳亚能生物技术有限公司提供(含PCR扩增体系、STS及内参照基因扩增引物)，DNA marker由天根生化科技(北京)有限公司提供(Cat.No.DM110413)。1.3 检测仪器 基因扩增仪(TC-4000，英国Techne)、电泳仪(Plex 200 SYSTEM，美国Bio-Rad)、紫外-可见分光光度计(UV-2600，日本SHIMADZU)、全自动凝胶成像系统(Gel Doc XR+，美国Bio-Rad)。

1.4 研究方法

1.4.1 基因组DNA提取 按照试剂盒说明严格操作，静脉抽取患者2 mL外周血，EDTA抗凝，混匀后取200 μL采用硅胶法进行外周血基因组DNA抽提，使用紫外-可见分光光度计确认DNA质量。

1.4.2 PCR扩增 运用多重PCR技术检测Y染色体AZFa、AZFb、AZFc、AZFd区域15个序列标签位点，4组多重PCR反应体系各25 μL，分为Ⅰ管、Ⅱ管、Ⅲ管、Ⅳ管。15对引物AZFa(SY82、SY84、SY86)、AZFb(SY143、SY127、SY124、SY133、SY128、SY134)、AZFc(SY254、SY242、SY255、SY239)、AZFd(SY152、SY145)和一对内控引物(SRY，472 bp)，目的片段长度见表1。PCR反应条件设置如下：94 ℃预变性10 min；94 ℃解链35 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，33个循环；72 ℃10 min后得到的PCR产物保存于4 ℃冰箱。

表1 Y染色体AZF微缺失检测中STS位点、对应区域及目的片段大小

1.4.3 核酸电泳 将各管中PCR产物于2.5%的琼脂糖凝胶(含溴乙锭为染色剂)上120 V电泳1 h，再置于紫外光凝胶成像系统上观察、记录对照及AZF条带的扩增、缺失情况。

2 结果

2.1 1 163例患者精液常规及AZF基因微缺失检测结果 在本院生殖中心发现的1 163例精液异常患者中，不明原因性无精症患者387例，梗阻性无精症患者8例，少弱精症患者686例、单纯少精子症患者82例。根据精液常规检查结果将患者划分为6组，分别为：(1)无精症组(不明原因)；(2)无精症组(梗阻性)；(3)轻度少弱精症组；(4)中度少弱精症组；(5)重度少弱精症组；(6)单纯少精症组。见表2。PCR扩增目的片段后琼脂糖电泳结果显示，1163例不育男性中出现Y染色体AZF区域微缺失的患者共有130例，总体缺失比例为11.18%。其中，无精症(不明原因性)患者AZF基因微缺失率为9.04%(35/387)，无精症(梗阻性)患者缺失率为1.25%(1/8)，轻度少弱精症患者缺失率为6.90%(4/29)，中度少弱精症患者缺失率为6.81%(22/323)，重度少弱精症患者缺失率为20.36%(68/334)，单纯性少精症患者缺失率为2.44%(2/82)。

表2 1 163例男性不育患者的精液参数及Y染色体AZF基因微缺失情况

2.2 130例Y染色体AZF基因微缺失患者缺失组合类型 上述130例Y染色体无精子因子微缺失患者4个区域的缺失发生率从高至低分别为：AZFc(95.38%,124/130)、AZFd(95.38%，124/130)、AZFb(20.77%,27/130)、AZFa(9.23%,12/130)。缺失的组合类型为：AZFa单独缺失、AZFc+AZFd组合缺失、AZFb+AZFc+AZFd组合缺失及AZFa+AZFb+AZFc+AZFd组合缺失，AZFb/c/d发生单独区域位点缺失及AZF4个区域中其它类型的组合缺失病例未在本研究中发现。本组中每种缺失类型的典型病例见图1。

注：泳道自左至右分别为：DNA marker，Ⅰ管，Ⅱ管，Ⅲ管，Ⅳ管。

图1 Y染色体AZF基因微缺失典型病例PCR扩增后2.5%琼脂糖凝胶电泳图

在各种缺失类型中，AZFc+AZFd组合缺失患者最多，共97例，占74.62%(97/130)，其次为AZFb+AZFc+AZFd组合缺失类型，共21例患者(16.15%,21/130)，AZFa+AZFb+AZFc+AZFd位点全部缺失及AZFa区域单独缺失患者分别为6例，各占总缺失患者人数的4.62%(6/1 163)。相关统计结果见表3。

表3 1 163例男性不育症患者Y染色体AZF基因微缺失组合类型

3 讨论

男性不育症可能由多种因素综合导致。基因因素在男性不育症中发挥着重要作用，无论是先天遗传性的，还是后天各种原因导致的常染色体、性染色体数量和结构的异常，都会以不同途径造成性腺轴或者精子发生、发育过程的异常，从而导致不育。

遗传性男性不育患者中，Y染色体无精子因子(AZF)微缺失发生率仅次于Klinefelter’s征排在第二位，常引起较为严重的精子数目、形态、活力异常[3]。AZFa、AZFb、AZFc、AZFd4个区域与精子的发生、成熟均存在某些内在关联，但AZF基因微缺失影响正常生精的过程和机制尚未完全阐明。现有资料表明，AZFa区域发生微缺失的患者生精组织的病理类型多为唯支持细胞综合征(SCOS)，临床表现多为无精子症；AZFb缺失通常与生殖细胞成熟停滞有关，影响其减数分裂，主要使其停留在精母细胞阶段；AZFc缺失较常见，影响精原细胞向精子细胞的转化，致多种无精子和严重少弱精子发生；由于AZFd的序列与AZFb和AZFc存在重叠，因而该区的缺失与上述两个AZF区域的微缺失临床、病理表现类似[7-9]。另外，部分AZF缺失患者会出现内分泌异常，具体表现为原发睾丸衰竭，睾丸发育障碍使睾酮产生减少，从而导致FSH增高、LH正常或相应不同程度的增高[10]。

统计资料显示Y染色体AZF基因微缺失在不育男性中的检出率为2%～10%不等，其中无精子症患者AZF微缺失检出率最高，约为18%，少弱精子症患者AZF微缺失检出率约为 14%、而单纯少精子症患者AZF微缺失检出率较低，仅为4%[11-12]。不同种族人群原发性男性不育症Y染色体微缺失的发生率高低不一，与种族差异与地域差异有关。本研究中安徽地区1 163例男性不育症患者无精因子微缺失的发生率约为11.18%，与国内外各中心的研究结果相近。同时，AZF缺失范围大小与男性精子生成障碍表现程度有紧密关联，AZFc区基因缺失越多的患者中精子数量有可能越少[13]。研究发现不同的AZF缺失类型与精子质量体现出一定的对应关系，AZF片段缺失范围越大，生精功能越差。值得注意的是，本研究发现男性不育患者多为多位点组合缺失，单一位点缺失较少，其中AZFc+AZFd位点同时缺失的类型最多，其次为AZFb+AZFc+AZFd组合缺失类型，AZFa+AZFb+AZFc+AZFd组合缺失以及AZFa单独微缺失的概率较低，其余类型的缺失组合则未在本组中发现。

我们的研究同时发现在本组1 163例不育男性中绝大多数未检测到AZF基因任何区域的微缺失，提示AZF基因微缺失不是导致无精症和少、弱精症乃至男性不育的唯一致病因素，隐睾、睾丸扭转、精索静脉曲张、鞘膜积液、免疫失稳、病原体逆行感染等也会影响睾丸的正常生精功能进而导致不育[14-15]。伴随着一系列辅助生殖技术的发展成熟，使得某些不育患者重拾了生育的信心，但考虑到各类AZF微缺失类型患者的不同生育结果以及AZF微缺失可能发生垂直传递的特点，对不育群体进行AZF检测、分型是十分必要的。

总而言之，Y染色体AZF基因微缺失检测帮助我们在分子生物学基因层面上了解了部分男性不育的发病原因，AZF微缺失给人们生育带来的困扰也逐渐被认知。AZF基因微缺失检测具有重要的理论与临床实践意义，有利于明确部分男性不育患者的病因并指导治疗方案的选择。

[1] Patrat C,Bienvenu T,Janny L,et al.Clinical data and parenthood of 63 infertile and Y-microdeleted men [J].Fertil Steril,2010,93(3):822-832.

[2] Miyamoto T,Minase G,Okabe K,et al.Male infertility and its genetic causes[J].J Obstet Gynaecol Res,2015,41(10):1501-1505.

[3] Pépin J,Valiquette L,Alary ME,et al.Clostridium difficile-associated diarrhea in a region of Quebec from 1991 to 2003:a changing pattern of disease severity[J].CMAJ,2004,171(5):466-472.

[4] Agarwal S,Agarwal A,Khanna A,et al.Microdeletion of Y chromosome as a cause of recurrent pregnancy loss[J].J Hum Reprod Sci,2015,8(3):159-164.

[5] Liu XG,Hu HY,Guo YH,et al.Correlation between Y chromosome microdeletion and male infertility[J].Genet Mol Res,2016,15(2):1502.

[6] Soares AR,Costa P,Silva J,et al.AZFb microdeletions and oligozoospermia——which mechanisms[J].Fertil Steril,2012,97(4):858-863.

[7] Wu Q,Chen GW,Yan TF,et al.Prevalent false positives of azoospermia factor a(AZFa)microdeletions caused by single-nucleotide polymorphism rs72609647 in the sY84 screening of male infertility[J].Asian J Androl,2011,13(6):877-880.

[8] Raicu F,Popa L,Apostol P,et al.Screening for microdeletions in human Y chromosome——AZF candidate genes and male infertility[J].J Cell Mol Med,2003,7(1):43-48.

[9] Wang RX,Fu C,Yang YP,et al.Male infertility in China:laboratory finding for AZF microdeletions and chromosomal abnormalities in infertile men from Northeastern China[J].J Assist Reprod Genet,2010,27(7):391-396.

[10] 王婕,牟红新,林峰.无精症及严重少精症患者Y染色体AZF微缺失区域与临床表型关系的研究[J].中国计划生育学杂志,2009,171(12):739-743.

[11] Lo Giacco D,Chianese C,Sánchez-Curbelo J,et al.Clinical relevance of Y-linked CNV screening in male infertility:new insights based on the 8-year experience of a diagnostic genetic laboratory[J].Eur J Hum Genet,2014,22(6):754-761.

[12] Viswambharan N,Suganthi R,Simon AM,et al.Male infertility:polymerase chain reaction-based deletion mapping of genes on the human chromosome[J].Singapore Med J,2007,48(12):1140-1142.

[13] Singh R,Kaleem AM,Narayana SS,et al.A case of oligoasthenoteratozoospermia with AZFc deletion and persistent oxidative stress[J].Indian J Hum Genet,2012,18(3):359-362.

[14] Su MT,Lee IW,Kuo PL.Presence of TSPY transcript and absence of transcripts of other Y chromosomal genes in a case of microscopic gonadoblastoma[J].Gynecol Oncol,2006,103(1):357-360.

[15] Zhang L,Hao ZY,Zhang XS,et al.Human papillomavirus sperm infection:a possible risk factor for male infertility[J].Asian J Androl,2014,16(6):929-930.

Azoospermia factor microdeletions on Y chromosome from 1163 male infertility patients in Anhui province

LIU Wen,HE Guoping,SONG Yaxian,et al

(ReproductiveMedicineCenter,TheAffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei,Anhui230001,China)

Objective To analyze the frequency and characteristics of azoospermia factor(AZF)microdeletions on Y chromosome from 1 163 infertile men in Anhui province and to discuss the diagnostic value of AZF microdeletions detection in male infertility.Methods Multiple polymerase chain reaction(PCR)techniques combined with agarose gel electrophoresis were applied to analyze 15 sequence tagged sites(STS)of the azoospermia factor(AZF)microdeletions among 1 163 male infertility patients with azoospermia or oligozoosperm in Anhui province.Results Among all the 1 163 infertile men,130(11.18%)cases were detected to have AZF microdeletions.As for combined types of AZF microdeletions,there were 97 cases(8.34%,97/1163)of AZFc+AZFd deletions,21 cases(1.81%,21/1 163)of AZFb+AZFc+AZFd deletions,6 cases(0.52%,6/1 163)of AZFa+AZFb+AZFc+AZFd deletions,and 6 cases(0.52%,6/1163)of AZFa deletions.Conclusions AZF microdeletion is one of the most important causes for sperm abnormality and subsequent male infertility.AZF microdeletion screening for infertile men with sperm abnormality is necessary to facilitate accurate diagnosis and optimal therapy.

Male infertility;Azoospermia;Oligozoosperm;Azoospermia factor;Y chromosome microdeletions

国家自然科学基金面上项目(81370749)

何国平，男，副主任医师，研究方向：产前诊断及男性不育症的诊治，E-mail:13865943124@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.018

2016-07-31，

2016-09-18)