利用SSR荧光标记分析山西糯玉米农家种的遗传多样性

李锐，白建荣，2,，张丛卓，张效梅，闫蕾，杨瑞娟

（1.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031；2.山西省农业科学院现代农业研究中心，山西太原030031；3.农业部黄土高原作物基因资源与种质创新重点实验室，山西太原030031）

利用SSR荧光标记分析山西糯玉米农家种的遗传多样性

李锐1，白建荣1，2,3，张丛卓1，张效梅3，闫蕾1，杨瑞娟1

（1.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031；2.山西省农业科学院现代农业研究中心，山西太原030031；3.农业部黄土高原作物基因资源与种质创新重点实验室，山西太原030031）

采取混合取样策略，利用荧光SSR技术对来源于山西省的45份糯玉米地方品种和40个位点进行了分析。结果表明，在45个糯玉米地方品种中，共检测出等位变异241个，每个位点检测出3～11个等位变异，平均每个位点6个；多态性信息量（PIC）变化范围在0.27～0.87，平均每个位点0.71；标记索引指数（MI）变化范围在1.35～9.53，平均每个位点4.42；聚类分析可将45份糯玉米地方品种划分为4个类群。结果显示，部分品种有许多特有的等位变异，应引起特别的注意，需作进一步的分析与研究。

SSR荧光标记；糯玉米；地方品种；遗传多样性；山西

糯玉米（Zea mays L.ceratina Kulesh）的糯质特性是由第9染色体发生的隐性突变（waxy）形成[1]。由于我国糯玉米主要是鲜食，因此，优质是糯玉米育种的首要目标，即营养价值高，口感好，果穗商品性好。针对育种目标，国内外选育糯玉米自交系通常采用的方法主要有回交转育法、杂交选育法和直接选系法。采用回交转育法或杂交选育法育成的糯玉米品种，在一定程度上仍保持普通玉米品质差的特性，这也正是造成目前我国糯玉米品种虽多，但符合鲜食要求的品种并不多的主要原因。采用直接选系法育成的糯玉米品种适口性较好，但用于直接选系的糯玉米地方品种大多遗传基础复杂，较难直接选系，选育的系配合力远远低于普通玉米自交系，从而造成目前适口性好的鲜食糯玉米品种大多产量较低[2]。因此，强化种质资源的研究，分析地方品种遗传多样性和亲缘关系，对于深化玉米遗传研究、提高糯玉米育种水平具有重要的意义。

山西省地形复杂，形成了许多的生态小气候。山西虽然不是糯玉米的起源地，但其他地方的糯玉米地方品种引进山西后，经多年的驯化后形成了较强的环境适应性和一些特殊的适应性状，并具有广泛的遗传变异性。到目前为止，很少有人对这些品种进行过遗传多样性的研究，这些品种的亲缘关系不清，育种利用非常困难。因此，研究和分析这些糯玉米地方品种的遗传多样性与亲缘关系，对于种质的利用具有重要意义。

随分子生物学技术的不断完善和发展，以DNA为基础的各种分子标记技术被广泛应用于玉米种质遗传多样性研究中，最先应用于普通玉米种质的遗传多样性研究中，随后在分析糯玉米种质遗传多样性方面也得到应用[3-11]。但常规SSR的聚丙烯酰胺凝胶银染法有许多缺点。为此，在表型特性分析基础上[12]，本研究利用全自动核酸分析仪SSR荧光标记检测技术，采用10株2池混合取样方法，建立这些种质的DNA指纹图谱，并分析它们的遗传多样性，旨在为山西糯玉米地方种质资源的保存和管理奠定基础，对糯玉米新品种选育提供指导性的方法和思路，以提高糯玉米的育种效率和育种水平。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 糯玉米材料针对山西省不同的地域和气候环境，广泛征集、整理糯玉米地方品种100余份，由山西省农业科学院农作物品种资源研究所提供。由于长期保存发芽率下降，只选择了符合试验要求的45份材料（表1）。

表1 山西糯玉米及其来源

1.1.2 SSR标记的引物采用建立国家玉米品种指纹库的20对核心引物和20对辅助核心引物[13]。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取、纯化和检测参照刘雪等[13]的方法混合提取群体DNA，每个群体4个样本，每个样本由10个单株（随机取样）的叶片混合而成。采用CTAB法提取并纯化DNA，用分光光度计检测DNA的质量和浓度，DNA的工作浓度设定为20 ng/μL备用。

1.2.2 扩增与产物荧光检测扩增反应在C1000扩增仪上进行。PCR反应总体系为20 μL，其中，10×PCR Buffer（25 mmol/L Mg2+）2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L SSR引物1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 U，DNA模板80 ng，ddH2O补至20 μL。PCR反应程序为：95℃预变性5 min，1个循环；94℃变性1 min，60℃复性30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后于72℃延伸10 min。扩增产物在生物大分子分析仪上完成。

根据生物大分子分析仪软件输出的数值建立数据库。标记位点多态性信息量（PIC）计算公式为PIC＝1-Σfi2，其中，fi为i位点的基因频率。标记索引系数（Marker Index，MI），按Senior等提供的公式计算，MI＝Allele×PIC，其中，Allele为该引物的等位基因数。

利用NTSYS-pc2.1软件，按照UPGMA方法对各材料进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 糯玉米地方品种遗传变异分析

由表2可知，45个糯玉米地方品种90个样品在40个SSR位点共检测出241个等位变异，每对引物检测出3～11个等位变异，平均6个；其中，bnlgl702kl位点有11个等位变异，bnlg240kl位点有10个等位变异。40个位点的多态性信息量PIC值变化范围在0.27～0.87，数据大部分集中在0.60以上，平均0.71。标记索引指数变化范围在1.35～9.53，数据大部分集中在4～6，平均4.42。总体来看，供试糯玉米地方品种的遗传多样性丰富，且数据均一性较好。

表2 用于SSR分析的引物信息和检测到的等位基因数目

2.245 个糯玉米地方品种的聚类分析

在相似系数0.67的位置将45份材料划分为4大群，其中，第1群包括5个品种，第3群包括4个品种，第4群只有和顺小白玉米，其余的在第2群。在相似系数大约0.69的位置将第2群的35个品种划分为4个亚群（图1）。

从图1可以看出，大部分品种之间的相似系数小于0.8，显示了45个糯玉米地方品种丰富的遗传多样性。在第2群的Ⅱ-2群中，隰县黏玉米-2和祁县小白玉米来源不同，但相似系数达到0.92。隰县黏玉米-1和隰县黏玉米-2来源相同，品名相同，但是相似系数仅为0.72；类似的情况还有吉县黏玉米-1和吉县黏玉米-2，相似系数仅0.71，划分于2个亚群内。

3 讨论

3.1 荧光SSR标记分析技术

基于生物大分子分析仪的SSR荧光标记检测技术是用荧光染料标记SSR扩增产物，精确分析扩增产物的片段长度。本研究首次将该技术应用于玉米的遗传多样性分析研究中，具有的优点为：（1）灵敏度高。传统电泳系统由于染色的问题，某些条带由于扩增产物少而不显色经常出现缺带的情况。由于生物大分子分析仪采用了荧光检测，灵敏度极高，没有出现这种情况，增加了数据的可靠性，并减少了重复验证的次数。（2）扩增产物分辨率高。传统电泳系统染色后，变性胶的分辨率在理论上为5 bp。但在实际操作中，往往由于电泳过程中整个胶面的电压、电流和功率处于不断的变化中，实际上电泳的迁移线随着电泳时间的延长而变的不水平，有时弯曲的程度很大，成为弧形，这样就影响了分辨率，特别是在满板、多样本的情况下，不知是实际片段长度的差异还是由于电场原因导致，造成读带困难。生物大分子分析仪采用的是峰图与胶图结合的形式，读数是用片段大小显示，并且有胶图作参考，结果准确。这种结合的功能优于定量PCR仪及测序仪等只有峰图显示的仪器。

3.2 糯玉米地方品种的收集与整理

由于地方品种是由当地农民长期选种和保存下来的种质，在长期生产和地方品种的扩散过程中，难免出现不同品种之间的混杂，“一种多名”和“同名异种”现象。本研究收集的有些品种具有同一名称，实际未必是同一个品种。例如，隰县黏玉米-1和隰县黏玉米-2来源相同，品名相同，但是是2个基因型；类似的情况还有吉县黏玉米-1和吉县黏玉米-2，相似系数仅0.71，划分在2个亚群内。另外，隰县黏玉米-2和祁县小白玉米来源不同，但相似系数达到0.92，基因型非常接近。这说明，地方品种仅从征集处得来的信息往往不可靠，有必要对这些地方品种作遗传分析，为这些种质资源的利用奠定基础。另外，研究结果显示，和顺小白玉米单独为一类，阳曲白黏玉米和阳曲黏玉米在第一类中属于独特的位置，这些品种可能有许多特有的等位变异，应引起特别的注意，需作进一步的分析与研究。

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［5］张金渝，张建华，杨晓洪，等.用SSR标记划分云南糯玉米地方品种遗传类群的研究[J].玉米科学，2007，15（1）：53-58.

［6］王鹏文，杨勇.利用SSR标记划分糯玉米的杂种优势群[J].华北农学报，2007，22（3）：35-38.

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［13］刘雪，李明顺，李新海，等.利用SSR标记分析玉米群体遗传变异的取样方法[J].作物学报，2005，31（7）：858-863.

Analysis of Genetic Diversity of Waxy Corn Landraces in Shanxi Using Fluorescent SSR Markers

LI Rui1，BAI Jianrong1，2，3，ZHANGCongzhuo1，ZHANGXiaomei3，YANLei1，YANGRuijuan1
（1.Institute ofCrop Sciences，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；2.Research Center ofModern Agriculture，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry of Agriculture，Taiyuan 030031，China）

Genetic diversity and genetic variation of waxy corn landraces in Shanxi were analyzed with 40 fluorescent SSR loci by using a bulk sampling strategy.The result showed that totally 241 alleles in 45 corn landraces were detected with an average of 6 ranged from 3 to 11 per locus.PIC among them ranged from 0.27 to 0.87 with an average of0.71 per locus.MI among them ranged from 1.35 to 9.53 with an average of 4.42 per locus.The 45 landraces were clustered into 4 groups.The results showed that some of them had their particular alleles,so that they should be paid more to study further.

fluorescent labeled SSR marker；waxy corn；landraces；genetic diversity；Shanxi

S513.032

A

1002-2481（2016）10-1433-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.10.02

2016-06-01

山西省科技攻关项目（20130311002-8）

李锐（1974-），男，山西静乐人，助理研究员，硕士，主要从事分子育种研究工作。白建荣为通信作者。