富锌益生素的制备及其培养条件的优化

■ 王金和 雷连成

(1.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062；2.河南牧业经济学院动物医学院，河南郑州 450046)

近年来，用微生物作为载体富集动物所必需微量元素是新型饲料添加剂研发方向之一。如以微生物为载体，可以富集铁、锌、硒、锗、铬等微量元素，使其具备益生菌和微量元素双重功效。研究表明，乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌均具有一定的微量元素转化能力[1-3]。本试验通过选择产朊假丝酵母、凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌做为制备富锌益生素的菌种，对其发酵条件进行优化，生产活菌数和锌转化率较高的富锌益生素产品，能够将益生菌、有机锌双重功效相结合，有助于动物对锌的摄取，可以提高动物对微量元素锌的吸收利用率，为临床开发和应用生物转化无机锌，形成具有活菌及有机锌的新型饲料添加剂提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 菌种

产朊假丝酵母（Candida utilis）：河南牧业经济学院微生物实验室保存菌种；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus Acidophilus）：购自苏州北纳创联生物技术有限公司，菌株编号BNCC338074；凝结芽孢杆菌（Bacillus coag⁃ulans）：购自苏州北纳创联生物技术有限公司，菌株编号BNCC168437。

1.2 培养基

1.2.1 活化培养基和种子培养基

产朊假丝酵母活化培养基：蛋白胨 5.0 g、葡萄糖 10.0 g、酵母膏 3.0 g、麦芽浸膏 3.0 g、琼脂 20.0 g、蒸馏水1 000 ml，pH值自然；产朊假丝酵母种子培养基[4]：蛋白胨 10 g、葡萄糖 40 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、蒸馏水1 000 ml，pH值自然。

嗜酸乳杆菌活化培养基：10%的脱脂乳培养基，pH值自然，115℃、15 min灭菌；嗜酸乳杆菌种子培养基：MRS肉汤培养基（购自上海易利生物科技有限公司）。

凝结芽孢杆菌活化培养基：普通营养琼脂培养基（购自青岛海博生物技术有限公司）；凝结芽孢杆菌种子培养基[5]：葡萄糖60 g、蛋白胨 10 g、酵母膏 5 g、蒸馏水1 000 ml，pH值7.5。

1.2.2 复合菌发酵培养基

参照孙杨（2015）方法[6]确定以上三种复合菌固体发酵培养基组成：麦麸18 g、玉米皮粉7.5 g、豆粕4.5 g、麦芽糖 0.45 g、红糖0.74 g、NH4Cl 0.3 g、(NH4)2SO40.3 g、CaCO30.15 g、KH2PO40.29 g、MnSO40.08 g、MgSO40.15 g，pH值自然，含水量（即干物料质量∶水的体积）为1∶0.8。流通蒸汽灭菌。

1.2.3 计数培养基

嗜酸乳杆菌计数培养基：GYP白亚琼脂培养基；产朊假丝酵母计数培养基：孟加拉红培养基；凝结芽孢杆菌计数培养基：普通营养琼脂培养基。均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.3 主要仪器

Qyc-211全温空气摇床（上海福玛实验设备有限公司生产），FA1104N电子天平（上海精密科学仪器有限公司生产），DK-S24电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司生产）、UV754紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司生产），低温粉碎机（江阴市金科粉碎机械有限公司）。

1.4 菌种活化与种子液获得

将产朊假丝酵母菌菌种接种于斜面活化培养基上，30℃、培养40 h；连续活化2～3次，再按照3%的接种量接种于种子培养基中，30℃、160 r∕min摇床培养13 h，获得产朊假丝酵母的液体种子液[7]。将嗜酸乳杆菌菌种接种于斜面活化培养基上，35℃、培养24 h，连续活化2～3次，再3%的接种量接种于种子培养基中，37 ℃、160 r∕min摇床培养24 h，获得嗜酸乳杆菌种子液。将凝结芽孢杆菌菌种接种于斜面活化培养基上，37℃培养24 h，连续活化2～3次，再接种子培养基中，37 ℃、200 r∕min摇床培养24 h，获得凝结芽孢杆菌种子液。将产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌种子液分别计数，活菌数均达到109以上再按照1∶1∶1比例配置成生产用混合种子液。

1.5 富锌益生菌培养条件的优化

1.5.1 硫酸锌溶液与固体发酵培养基配比对益生菌生长和锌转化率的影响

配置锌浓度为 50 mg∕ml的硫酸锌溶液[8]，121 ℃高压灭菌30 min后备用。将硫酸锌溶液加入复合菌固体发酵培养基中，硫酸锌溶液与固体发酵培养基比例分别为 1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300。将混合种子液5%接种于复合菌固体发酵培养基中，搅拌均匀后装入浅盘35℃培养36 h。培养结束后分别进行产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌活菌计数，同时测定有机锌转化率。

1.5.2 益生菌接种量对益生菌生长和锌转化率的影响

将混合种子液分别按照1%、2%、5%、7.5%、10%接种于复合菌固体发酵培养基中，硫酸锌溶液与固体发酵培养基比例为1∶200；搅拌均匀后装入浅盘35℃培养36 h。培养结束后分别进行产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌活菌计数，同时测定有机锌转化率。

1.5.3 培养温度对益生菌生长和锌转化率的影响

将50 mg∕ml硫酸锌溶液与固体发酵培养(基培养基比例按照1∶200)加入复合菌固体发酵培养基中，将混合种子液5%接种于复合菌固体发酵培养基中，搅拌均匀后装入浅盘分别以20、25、30、35、37、45 ℃培养36 h。培养结束后分别进行产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌活菌计数，同时测定有机锌转化率。

1.5.4 培养时间对益生菌生长和锌转化率的影响

将50 mg∕ml硫酸锌溶液与固体发酵培养基1∶200的比例加入复合菌固体发酵培养基中，将混合种子液5%接种于复合菌固体发酵培养基中，搅拌均匀后装入浅盘以35℃分别培养30、36、48、72 h。培养结束后分别进行产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌活菌计数，同时测定有机锌转化率。

1.5.5 烘干温度的对益生菌活菌数的影响

发酵结束后，称取等质量的发酵物料于托盘（托盘内部放一张滤纸）中，将托盘置于真空干燥箱内烘干。并设置4个温度梯度50、60、70、80 ℃，处理1 h后，每个变量三个平行，处理完毕后计数活菌数。

1.6 富锌益生素制备

1.6.1 富锌益生素获得

将浓度为50 mg∕ml硫酸锌溶液加入复合菌固体发酵培养基中（硫酸锌溶液与固体发酵培养基比例为1∶200），将混合种子液按照5%接种量接种于复合菌固体发酵培养基中，搅拌均匀后装入浅盘35℃培养36 h，浅盘表面及内层长满菌体后温度提高至60℃，加大风量，干燥后低温粉粹，得到富锌益生素饲料添加剂。同时检测富锌益生素活菌数及有机锌转化率。

1.6.2 富锌益生素安全性试验

取健康1日龄雏鸡60只，随机分为试验组和对照组2组，每组30只。试验组按照常规日粮试验设计剂量最高量的10倍添加富锌益生菌（2 000 g∕t），常规饲养管理。连喂5周，每天观察一次，观察雏鸡生长和发病，5周后每组随机抽取6只剖检，检查雏鸡内脏器官有无病理变化。

1.7 检测指标及方法

1.7.1 活菌数检测

嗜酸乳杆菌活菌、产朊假丝酵母活菌、凝结芽孢杆菌活菌数测定分别按照文献[9-11]进行。富锌益生素活菌数检测：取10 g富锌益生素，用灭菌生理盐水做10倍梯度稀释，分别取不同稀释度益生素稀释液0.1 ml，均匀涂布于不同菌种固体培养基，每个稀释度3个重复，以每个平板上生长30～300个菌落作为计数标准，培养后活菌计数。

1.7.2 有机锌转化率测定

参照高永慧(1998)[12]的方法，采用原子吸收分光光度法测定锌含量，富锌益生素1∶5稀释后，3 000 r∕min离心8 min，分别测定沉淀物和上清液锌含量，有机锌转化率(%)=沉淀物锌含量∕总锌含量×100(总锌含量为沉淀物和上清液含锌量之和)。

2 结果

2.1 硫酸锌溶液与固体发酵培养基配比对益生菌生长和锌转化率的影响（见表1）

表1 硫酸锌溶液与发酵培养基配比对益生菌生长和锌转化率的影响

由表1可知，当硫酸锌溶液与发酵培养基配比1∶200时，发酵物中产朊假丝酵母数量4.83×108CFU∕g，达到最大；当硫酸锌溶液与发酵培养基配比1∶100时，嗜酸乳杆菌数量5.67×108CFU∕g，达到最大；当硫酸锌溶液与发酵培养基配比1∶200时，发酵物中凝结芽孢杆菌数量6.61×109CFU∕g，达到最大。当硫酸锌溶液与发酵培养基配比1∶200时，锌的转化率是76.47%，达到最大。因此，综合考虑，确定硫酸锌溶液与发酵培养基最佳配比1∶200。

2.2 益生菌不同接种量对益生菌生长和锌转化率的影响（见表2）

表2 益生菌接种量对益生菌生长和锌转化率的影响

当接种量是5%时，发酵物中产朊假丝酵母数量4.91×108CFU∕g，嗜酸乳杆菌数量5.79×108CFU∕g，达到最大；当接种量是7.5%时,发酵物中凝结芽孢杆菌数量6.86×109CFU∕g，达到最大；当接种量是5%时，锌的转化率是76.58%，达到最大。因此，综合考虑确定种子混合菌液在发酵培养基的最佳总接种量为5%。

2.3 不同的培养温度对益生菌生长和锌转化率的影响（见表3

当培养温度25℃时，产朊假丝酵母数量4.81×108CFU∕g，达到最大；当培养温度35℃时，嗜酸乳杆菌数量是 5.68×108CFU∕g，达到最大；当培养温度37 ℃时，凝结芽孢杆菌数量6.88×109CFU∕g，达到最大。当培养温度25℃时，锌的转化率是76.82%，达到最大。综合考虑，生产富锌益生素必须保持足够的益生菌数量和锌转化率，确定益生菌适宜培养温度为35℃。

2.4 不同培养时间对益生菌生长和锌转化率的影响（见表4）

表3 不同的培养温度对益生菌生长和锌转化率的影响

表4 培养时间对益生菌生长和锌转化率的影响

当培养时间为36 h，产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌的生长量达到最大，分别为4.86×108、5.67×108CFU∕g；培养时间为36 h时，凝结芽孢杆菌数量为5.88×109CFU∕g，也相对也较高；锌的转化率在培养36 h

后，锌的转化率达到76.82%，36 h后，虽有一定的增长，但不十分明显。因此，综合考虑三种益生菌的生长情况和锌的转化率，确定适宜培养时间为36 h。

2.5 不同烘干温度对益生菌活菌数的影响(见表5)

表5 烘干温度对益生菌活菌数的影响

随着烘干温度的升高，三种益生菌的活菌数均在减少，凝结芽孢杆菌活菌数下降最小。当烘干温度从50℃升高到60℃时，产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌活菌数分别下降了5.89%、7.29%、2.73%；当烘干温度从50℃升高到70℃时，产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌活菌数分别下降了39.16%、42.17%、11.79%；综上所述，发酵后烘干工艺的温度选择60℃。

2.6 富锌益生素的制备

按照上述优化的工艺条件制备得到富锌益生素，活菌数和锌转化率见表6。富锌益生素产朊假丝酵母含活菌数5.2×108CFU∕g；嗜酸乳杆菌含活菌数6.4×108CFU∕g；凝结芽孢杆菌含活菌数7.91×109CFU∕g。富锌益生素的总活菌数为9.07×109CFU∕g，有机锌转化率为79.82%。

表6 富锌益生素活菌数及锌转化率

2.7 富锌益生素安全性试验结果

用10倍剂量的富锌益生菌，连续饲喂5周后的安全性试验结果表明，试验组和对照组的雏鸡存活率均为100%；试验组和对照组采食情况正常，精神状态均良好，试验组粪便颜色蓬松，均未有异常状况；每组随机剖检6只鸡检查结果发现，雏鸡肌胃、腺胃、肠道及内脏均正常，病理学检查未见异常变化。

3 讨论

微量元素生物学利用率一直是动物饲料添加剂研究的重要课题，对无机微量元素进行有机转化，提高其生物学利用率，是有效的手段。目前研究比较多的是锌和硒元素。有益菌转化有机硒制备的产品或研究比较多。目前文献报道微生物对锌的转化主要使用酵母菌，如富锌酵母的研制。本试验同时利用三种有益菌转化无机锌，此方面的文献报道不多，但单个菌种对无机锌的转化和利用，均有报道。文献研究表明，酵母菌、乳酸菌和芽孢杆菌均具有一定的富集及转化微量元素的能力，尤其以酵母菌对微量元素的转化能力强[13]。胡振英等（1997）[8]研制了富锌酵母，获得了具有较高产率的富锌酵母菌株，其含锌量达15 000 μg∕g。孔林等(2006)[14]研制了富锌酵母的制备工艺，酵母菌的富锌总量可达到130 mg∕l。乳酸菌也具有将无机锌转化为有机锌的能力。陈健凯(2005)[15]研制了富锌酸奶，其含锌量达到500.06 mg∕g。陈瑶等（2009）[16]从发酵酸菜、酸奶中分离出6株具富锌能力的乳酸菌，并研究了富锌乳酸菌培养基优化。芽孢杆菌具有和微量元素相互促进的作用，连宾等（1990）[17]研究了微量元素锌、锰对地衣芽孢杆菌的影响，结果表明锌、锰具有促进地衣芽孢杆菌生长和芽孢形成的作用，适当浓度的Zn、Mn离子能够维持地衣芽孢杆菌高温下的生长。陈美娜等（2013）[18]研究结果表明，微量元素锰可以影响地衣芽孢杆菌的生长曲线，促进其芽孢的形成和菌体活性。

产朊假丝酵母及枯草芽孢杆菌的营养条件较低，而嗜酸乳杆菌能利用酵母培养物进行生长，因此它们是互利共生的[19]，故本试验选择了三种益生菌的接种比例为1∶1∶1。益生菌接种量直接关系到发酵后活菌数的多少，发酵效果的优劣，接种量过低导致微生物生长量不足，发酵周期延长和发酵不彻底；而接种量过高，容易造成微生物生长过度导致底物缺氧，微生物活性产物(如酶)的分泌受到抑制，同时也会过快地消耗养分，从而发酵效果变差[20]。从本试验结果来看，当接种量达到5%，益生菌接种量对益生菌生长和锌转化的影响最佳。硫酸锌溶液与固体发酵培养基配比关系，对益生菌生长和锌转化率有一定影响，硫酸锌溶液添加量越大时，对益生菌生长有抑制作用，活菌数和锌转化率越低，当培养基中锌浓度较高时抑制作用越明显，在发酵培养基中添加适量锌，不但能够对益生菌的生长繁殖无抑制作用，反而能有一定的促进作用[21]。

本试验结果显示了硫酸锌溶液与固体发酵培养基配比为1∶200时，活菌数及锌转化率可以达到最佳平衡。温度过高或过低均影响发酵效果，本试验中酵母菌适宜的培养温度较低，酵母菌培养在25℃以后，活菌数逐渐下降，但在35℃,下降幅度不大，嗜酸乳杆菌及凝结芽孢杆菌适宜的培养温度较稍高，所以35℃或37℃，对其活菌数影响不大，综合考虑，选择35℃做为培养温度。