大鼠腮腺组织放射后差异表达基因谱的构建及生物信息学分析

于潇，王代友，曾祥林

（广西医科大学，广西 南宁 530000）

大鼠腮腺组织放射后差异表达基因谱的构建及生物信息学分析

于潇，王代友，曾祥林

（广西医科大学，广西 南宁 530000）

目的探讨全基因芯片对放射后腮腺组织表达谱的差异及相关生物信息学的重要基因、通路。方法选用SD大鼠12只，随机分为空白组和放射组，每组各6只，一次性给予放射组60Co-γ射线15Gy的局部照射，空白组大鼠只腹腔注射10%水合氯醛。照射后2 h，无菌条件下迅速取出大鼠腮腺，投入液氮冷却。将提取的腮腺组织的总RNA进行Cye Dye Labeling荧光标定及Phalanx OneArray-TM杂交反应，利用含有20717个基因的ROAv2 RatOoeArray全基因表达谱芯片进行差异基因的筛选，将|log2（Ratio）|≥1作为筛选阈值。对筛选出的差异基因进行GO功能分类和Pathway通路分析。结果差异表达基因913条，上调基因455个，下调基因458个。将差异基因的功能概括为13类，包括代谢、细胞死亡、转录、应激等相关基因。对913个基因的Pathway通路有显著改变的通路共有13条，包括75个差异表达基因，其中7个涉及13条改变通路：Akt1、Pik3r1、Pik3cg、Nfkbia、Kras、Mapk13、Casp8。结论60Co-γ射线可使正常的大鼠腮腺组织中的基因表达水平发生改变。Akt1、Nfkbia、TPM1在放射后腮腺组织中的的基因表达改变有待于进一步研究。

腮腺;放射效应；基因表达；肿瘤

头颈部恶性肿瘤是常见的肿瘤之一，目前最常用的治疗方法：手术治疗、放射疗法和化学药物治疗[1]。放射治疗常规治疗方法之一。接受放射治疗后，生存率和治愈率大幅度提高，对局部复发、肿瘤远处转起到一定的抑制作用。同时放射线又是肿瘤的致病因素之一。放射线对正常组织、癌旁组织也造成一定的损伤，甚至出现一系列的并发症[2]。

不同组织对放射线的敏感性不同，腮腺对放射线较敏感，因此，常对腮腺造成放射线损伤[3]。放射治疗引起的继发性放射性癌变也日益增多，放射性癌不但可发生于第一次口腔癌放疗以后，也可发生在腮腺周围组织放疗之后[1]。研究表明：15Gy剂量的放射可引起腮腺损伤，但疾病的发生发展由基因编码的蛋白操控，基因表达改变引起的腮腺组织变化需要一定时间。为此，我们应用全基因芯片表达谱对放射后腮腺组织进行整体的研究。现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般材料 SD大鼠12只(广西医科大学医学动物实验中心)、Agilent RNA 6000 Nano Kit(5067-1511, Agilen公司)、Onearray Amino Allyl aRNA Amplification Kit(Phalanx公 司)、Amersham Cy5 NHS Ester (PA15106，GE公司)、Whole Genome Experssiomicroarray(Phalanx公司)、Agilent 2100生物分析仪(G2940CA，Agilent公司)、NanoDrop分光光度计(ND1000，Thermo Fisher公司)PCR System(9700，Applied Biosystem公司)、Hybridization oven(HR-80，COCONO公司)、AgilentMicroarray Scanner(G2505C，Agilent公司)、60Co-γ 照射源(广西医科大学第一附属医院西院)

1.2 方法

1.2.1 标本采集 选用SD大鼠12只，体重在180～200 g左右。按随机数字表法分为空白组（0Gy）和放射组（15Gy），每组各6只，对空白组及放射组大鼠进行腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后对放射组一次性给予60Co-γ射线15Gy的局部照射。空白组不照射。照射后2 h，无菌条件下迅速取出大鼠腮腺，剃去筋膜及结缔组织，用RNase-free的生理盐水迅速漂洗样本，以去除血渍和污物。放入提前预冷的冻存管中，迅速投入液氮中冷却。

1.2.2 样本RNA的提取、纯化及检测 使用TRIzol试剂盒，分别将空白组和实验组标本中的总RNA提取出来，使用QIAGENRaeasy Kit分别对两组的总RNA进行纯化，严格按照试剂盒说明操作。测定OD值，并做其他的RNA质量检测（包括吸光度测定、RNA质量数测定以及琼脂糖凝胶电泳）。

1.2.3 荧光标定及片段化处理 取aRNA 15 ug，Couplingbuffer 9 ul，H2O 13.5 ul以及Cy5-NHS 1.5 ul混合均匀，轻微离心，在室温下反应，反应过程共30min，注意避光，完成标定反应。并对其进行纯化，得到了已完成标定、荧光染色、纯化的反义RNA，并进行吸光度、标记效率测定，使用冰箱-20℃冷冻保存。取两组已标记好的RNA各15 ug，各加入Cot-1 10 ul以及10x片段化缓冲液30 ul配置成片段化反应液；将反应液放在70℃PCR仪中，15min后取出置于冰上。加入3 ul终止液后，完成片段化处理，室温，避光储存。

1.2.4 芯片杂交 在杂交反应前必须进行前杂交处理，其目的是：降低背景值，提高讯号噪声比。取出完成前杂交处理的芯片，将其与空白芯片（含垫片）对夹。将热缩膜套在两芯片外侧，放入烧杯水中（90～95℃），进行热缩。完成后放在50℃烘箱内。将足量NewOA Hyb Buffer（182 ul）加入片段化aRNA的PCR管中，放入PCR仪中在95℃下开始变性反应，5min后以60℃恒温。然后将液体从芯片热缩膜切口处倒入，套上第二层热缩膜，完成热缩后，放入烘箱反应16 h，温度50℃，转速120 rpm/h。最后应用杂交清洗液清洗芯片，甩干水分，放入黑色芯片盒中，避光备用。

1.3 影像扫描与数据撷取 应用Agilent Microarray G2505C扫描仪对芯片进行扫描，借由扫描仪XDR的功能，分辨率为10 um，使用PMT 100%与10%的分辨率进行两次扫描。再利用GenePix™4进行影像数据撷取，获得两份初级数据，对数据进行均一化处理。

1.4 生物信息学分析 以|log2(Ratio)|≥1作为阈值判定标准（即Ratio≥2和Ratio≤0.5），进行显著性差异表达基因的筛选；用上海卓立工司提供的软件对差913条差异基因进行分析，包括GO功能分类和Pathway通路分析等，通路显著性的选择标准是P＜0.05，以其为阈值选择相关通路。

2 结果

2.1 样品总RNA质量检测

2.1.1 RNA纯度及质量检测结果 标准为总RNA含量不小于6μg，A260/A280比值在1.8～2.1之间。本试验中正常腮腺及放射后腮腺的样品总RNA均在6μg以上，A260/A280比值分别为2.00和2.01，符合要求（见表1）。

表1 Phalanx OneArray®基因表达RNA质量检测

2.1.2 RNA整体质量测定结果 RIN即RNA分子完整数，范围为1～10，较高值表示总RNA整体质量较好，标准为样品的RIN≧6（见表1）。

2.1.3 RNA完整性测定结果 观察电泳图上样品中28 S及18S核醣体RNA条带，电泳图上条带清晰，表明其完整性较好。该RNA电泳28 S及18 S清晰可见（图1）。

图1 RNA琼脂电泳图像

2.2 基因芯片生物信息学分析

2.2.1 整体上差异基因的表达及分布情况

图2 正常腮腺与放射后腮腺芯片对比火山图

2.2.2 差异表达基因的筛选 本实验将差异基因的筛选条件设定为log2|Fold change|≥1且P＜0.05。聚类后经过软件分析，共有差异表达基因913个，包括上调455个和下调458个。

2.2.3 GO功能分类 差异表达基因13类，包括：代谢、细胞死亡、转录、应激、信号转导等相关基因(表2)。

表2 GeneOntology生物学过程分类（个）

2.2.4 差异明显基因的注释：将|Ratio值|降序排列，选取上调、下调基因各10个差异最明显的基因。通过NCBIgenebank以及Gene Ontology数据库，检索分析上调和下调前10个基因中每个基因的信息（见表3、表4）。表3为上调前10名基因，表4为下调前10名基因。

2.2.5 差异表达基因的pathway通路分析：显著改变的通路共有13条，包含75条差异基因，其中有7个基因涉及13条改变通路：Akt1、Pik3r1、Pik3cg涉及8条通路，Nfkbia涉及7条通路，Kras涉及6条通路，Mapk13涉及5条通路，Casp8涉及4条通路（见表5）。

表3 表达上调前10名差异基因

表4 表达下调前10名差异基因

表5 7个主要基因的Pathway通路分析

3 讨论

对大鼠进行15 Gy放射后，其腮腺的蛋白量减少，大鼠腮腺组织发生损伤[4，5]。放射后2 h，细胞对放射线最敏感，细胞中各基因表达的变化最大，超过该时间点，会出现各种调节机制。利用含有20717个基因的ROAv2 RatOoeArray全基因表达谱芯片对两张芯片进行分析，共获得差异表达基因913个，其中上调基因455个，下调基因458个。使用GO分类和Pathway通路分析差异表达基因，发现913个差异表达基因共分为13类；13条通路有显著改变，有75个差异表达基因存在于改变的通路中，其中7个基因涉及13条改变通路：Pik3cg、Nfkbia、Akt1、Pik3r1、Kras、Mapk13、Casp8。

这7个基因均与癌症的发生发展有关，上调基因为：Pik3cg和Nfkbia；下调基因为：Akt1、Pik3r1、Kras、Mapk13、Casp8。Nfkbia、Mapk13、Casp8等基因在肿瘤组织中的表达下调，对肿瘤的发生发展有抑制作用；口腔鳞状细胞癌中，Kras基因突变位点位于突变频率较高的第12、13、61、147位氨基酸所在的密码

子[6]；Akt1基因在肿瘤组织中高表达，参与肿瘤转移；Pik3cg和Pik3r1属于PI3K基因的亚基，PI3K基因编码的蛋白在口腔鳞癌组织中阳性表达率较高，提示PI3K可能与口腔鳞癌的发生有关[7]。Akt1、Pik3cg和Pik3r1均参与PI3K/AKT细胞转导通路，该通路能够促进肿瘤的发生发展。

由于这7个基因涉及13条改变通路（100%），因此我们可以认为这7个基因与放射后组织发生癌变有密切关系。本研究中，Akt1、Nfkbia、TPM1的表达改变情况与以往研究结果相反，需进一步明确这3个基因在放射后腮腺组织中的作用。

[1] 邱蔚六.口腔颌面外科学［M].6版，北京：人民卫生出版社，2008: 232-274.

[2]Zheng J，Zhang C，Jiang L，etal.Functional NBS1 ploymorphism is associated with occurrence and advanced disease status of nasopharyngeal carcinoma［J].MolCarinog，2011，50(9):689-696.

[3]Liao CT，Chang JT，Wang HM，etal.Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in Pt1-3N0 oral cavity cancer with tumour-free mardins and perineural invasion［J].Int JRadiatOncol Biol Phys，2008，71(2):371-376.

[4]黄光斌，王中和.口腔颌面部修复组织瓣的放疗反应观察［J].实用口腔医学杂志，2002，（2）:134-136.

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The Construction of Differentially Expressed Genes Spectrum of Parotid Gland Tissue In Rats After Radiation and Bioinformatics Analysis

Yu Xiao，Wang Daiyou,Zeng Xianglin
(Guangxi Medical University,Nanning 530000,Guangxi)

ObjectiveTo investigate the gene chip,the difference of the expression of parotid gland tissue after radiation spectrum and related important genes and pathways of bioinformatics.Methods12,only choose SD rats were random ly divided into blank group and radiation group,each group 6,60 co radiation group-once gamma-ray gy 15 local irradiation,blank group rats by intraperitoneal injection of only 10%chloral hydrate.2 h after irradiation,aseptic conditions quickly remove the parotid gland of rats,liquid nitrogen cooling.Parotid gland tissue extraction of total RNA Cye Dye fluorescent Labeling calibration and Phalanx One Array TM hybridization reaction,using contains 20717 genes ROAv2 Rat OoeArray®all gene expression profile chip for differences in gene screening,w ill|log2(thew ire)|1 asa screening or threshold.To GO to screen out the difference of gene function classification and Pathway Pathway analysis.Results913 differentially expressed genes,raised 455 genes,cut458 genes.The function of the genetic variations will be divided into 13 classes,including metabolism,cell death,transcription,stress related genes.Pathway Pathway of 913 genes significantly change access article 13,including 75 differentially expressed genes,including seven involves 13 change pathways:Akt1,Pik3r1, Pik3cg,Nfkbia,Kras,Mapk13,Casp8.Conclusion60 co-gamma rays can make the level of gene expression in the parotid gland tissue of rats with normal change.Akt1,Nfkbia and TPM 1 gene expression changes of parotid gland tissue after radiation needs to be further research.

Parotid gland,Radiation effect;Gene expression;Tumor

R818.74

：A

：1008-4118（2016）02-0004-05

10.3969/j.issn.1008-4118.2016.02.002

2016-02-11

王代友。E-mail:wangdaiyou@sina.com