牛致病性大肠杆菌菌影的制备

王士霞，常春龙，翟军军，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319）

牛致病性大肠杆菌菌影的制备

王士霞，常春龙，翟军军，倪宏波*

（黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319）

制备牛源大肠杆菌菌影，为其作为疫苗及载体奠定基础。将裂解质粒PHH43-E电转入牛大肠杆菌中，并通过温度的改变诱导细菌裂解，即其在37℃条件下生长到对数生长期，然后进行42℃升温诱导。经温控诱导裂解质粒表达后可将细胞壁裂解，形成细菌空壳，成功制备了菌影。

牛；致病性大肠杆菌；菌影；制备

菌影（bacterial ghosts）又称菌蜕，是无繁殖能力、缺乏细胞浆和核酸的细菌空壳，通过噬菌体PhiX174的裂解基因E在革兰氏阴性菌内表达而形成[1-3]。裂解基因E表达后，细菌的内外膜融合形成跨膜孔道，在渗透压的作用下，细菌基因组和胞浆等内容物通过跨膜孔道排出，留下细菌空壳，即形成一种空的“菌影”[4-5]。菌蜕完好地保留了菌体表面的各种抗原的天然结构和粘附活性，可以类似活菌体诱导机体产生良好的免疫保护反应[6-7]，此外，研究表明菌影还具有极好的载体和佐剂功能[8]，目前，裂解基因E诱导制备菌影的技术已经广泛用于多种革兰氏阴性菌菌影的制备[9-10]。

成功制备菌蜕的关键是噬菌体phiX174的裂解基因E在宿主细胞内的高效表达。目前的表达系统有：温度敏感型λpL/pR-cI857启动子/阻遏子系统、化学诱导型LacpO-LacIq启动子/阻遏子系统、Pm-xylS启动子/阻遏子系统或者tol表达系统。目前应用最多的是λpL/pR-cI857启动子/阻遏子表达系统。

本试验拟利用λpL/pR-cI857启动阻遏系统，通过改变温度调控裂解基因E的表达，来制备制备致病性大肠杆菌菌影，为进一步研制和开发大肠杆菌新型疫苗及新型佐剂进行前期的探索。

1 材料与方法

1.1材料裂解质粒pHH43-E质粒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所细菌室惠赠；牛源致病性大肠杆菌为本实验室分离并保存；Taq DNA聚合酶购自美国Fermentas公司；DL2000 DNA marker购自Takara（大连）公司；氯霉素购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1 大肠杆菌感受态的制备 按照文献[11]，-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2 质粒的电转及鉴定 将1.2.1制备的感受态细胞从-80℃冰箱中取出置冰上待融化后加入1 μL的裂解质粒pHH43-E，按照常规电转的方法进行电转，参数为12.5 kV/cm、200 Ω、25µF、4.9 ms。将电转后的质粒摇菌并涂板，放置37℃温箱过夜培养。第2天挑取单菌落进行37℃摇菌，并进行菌液PCR鉴定。

1.2.3 裂解条件的优化 在5 mL含34 μg/mL氯霉素的LB培养液中接种含裂解质粒的菌株，37℃过夜震荡培养。转接后37℃培养至OD600值分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2。然后升温至42℃诱导表达。每隔15 min取样测定OD600值，直至培养物的OD600值不再下降为止。同时取适量菌液，用无菌PBS稀释适当倍数后涂板进行菌落计数（每板涂100 μL菌液）。

1.2.4 菌体裂解率的计算 取诱导之前100 μL的菌液和诱导之后的100 μL菌液分别稀释合适倍数，涂布于含有氯霉素的LB平板，37℃过夜培养，计算活菌数。

裂解率（%）＝（1-诱导后CFU/诱导前CFU）×100%

2 结果

2.1溶菌质粒的鉴定以电转化后的单菌落的过夜培养物为模板进行菌液PCR鉴定，结果如图1所示，在1 429 bp处有一条特异性条带，与预期相符。

图1 裂解质粒PHH43-E成功转入大肠杆菌结果图Fig.1 Plasmid PHH43-E was successfully transferred to E.coli results map

2.2不同初始浓度诱导下的裂解情况观察42℃诱导后，裂解情况观察结果，与对照组相比，0.4和0.6时，差别最明显，因此，0.4和0.6时，裂解效果好。

2.3不同起始浓度裂解曲线分别对起始浓度为0.4、0.6、0.8、1.0和1.2时其进行了裂解曲线的绘制，但因试验中起始浓度为0.8、1.0和1.2的裂解效果不是很好，所以只对起始浓度为0.4和0.6的裂解曲线进行了分析，由图3可看出，当初始浓度为0.6时，该曲线较为平稳，且OD值也较低，菌落数较少。因此，起始浓度为0.6时为最佳起始浓度。

2.4 裂解率计算结果将升温诱导之前和诱导结束后2～3 h的菌液分别用无菌PBS进行105和103倍稀释，重复3次试验后取平均数，37℃恒温箱培养24 h，分别计算诱导前细菌数和诱导后菌液浓度。

裂解率=1-5.8×103/5.2×106=99.89%

3 分析与讨论

本试验将pHH43-E裂解质粒成功转入大肠杆菌中，含有裂解质粒的大肠杆菌在37℃条件下培养至对数生长期后，升温诱导制备大肠杆菌菌影。升温诱导15 min后OD600值达到最高之后下降，在诱导60 min后OD600值下降到最低，同时菌液最为澄清，并稳定持续60 min不再变化。

图2 不同初始浓度诱导下的裂解结果Fig.2 Under different initial concentration induced cracking results

图3 裂解曲线的绘制结果Fig.3 Plot results of pyrolysis curve

将不同起始浓度的菌液同时进行升温诱导，对比其裂解是否有差异，筛选出裂解效率最高的起始浓度。结果显示，菌液起始浓度OD600值为0.4或0.6左右时升温诱导，其裂解效率要明显高于起始浓度OD600为0.8、1.0和1.2时的裂解效率。虽然起始浓度OD600值为0.4和0.6时的裂解效率相近，但是由于菌液起始浓度为0.6时，OD600值较为平稳，因此，本试验选择菌液浓度为0.6作为起始菌液诱导浓度。

本试验中采用的裂解系统为目前应用最多λpL/ pR-cI857温控表达系统。最初的λpL/pR-cI857系统在温度低于30℃时，阻遏蛋白cI857的表达使基因E被稳定抑制；温度高于30℃时，阻遏蛋白cI857热失活，导致基因E表达；在42℃时，细菌裂解达到最佳状态。由于30℃时培养细菌不利于菌体的大量繁殖，同时，当温度由30℃向42℃转变时，热冲击会对细胞表面的抗原决定簇产生影响，因此，通过基因定点突变技术，使λpL/pR启动子的操纵基因OR2中的一个碱基由T诱变为C，突变后在37℃下也能稳定抑制基因E的表达，经此改造后，该温控表达表达系统的热稳定性大大提高[12]，这对细菌菌影的制备提供了便利条件。

在菌影制备过程中，100%的完全裂解往往不易实现，为了达到完全灭活，笔者采用冻干法将制备的菌影冻干两次，每次置于冻干机中冻干12 h，经过检测细菌已被完全灭活，其原因可能是细菌在冻干的过程中会有一部分活菌死亡，在不加保护剂的情况下死亡的细菌数量会更多，而且菌影中存留的活菌数量本身很低，导致菌影在冻干过程中存留的少量活菌被全部灭活，但是在此过程中，菌体可能由于反复冻融可能受到破坏，导致其免疫原性降低。因此提高菌影的打孔效率将是今后研究的重点。

参考文献

[1]Koller V J,Dirsch V M,Beres H,et al.Modulation of bacterial ghosts-induced nitric oxide production in macrophages by bacterial ghost-delivered resveratrol[J]. FEBS J, 2013,280(5):1214-1225.

[2]Yu SY,Peng W,Si W,et al.Enhancement of bacteriolysis of shuffled phage PhiX174gene E [J].Virol J,2011,8:206

[3]孙颖，金天明，冯立文，等.利用E.coli-App穿梭载体构建温控双基因裂解载体pMC-WK[J].中国兽医学报，2011，33（9）：1304-1308.

[4]Ebensen T,Paukner S,Link C,et al.Bacterialghostsareanefficientdeliverysystem for DNA vaccines[J].The Journal of Immunology,2004,172:6858-6865.

[5]Witte A,Wanner G,Sulzner M,et al.Dynamics of PhiX174protein E mediated lysis of Escherichia coli[J]. Arch Microbiol, 1992 ,157 (4):381-388

[6]Szostak M,Lubitz W. Recomebinant bacterial ghosts as multivaccine vehicles[J]. Vaccines,1991,91:409-414.

[7]Witte A,Blsi U,Halfmann,et al.PhiX 174 protein E mediated lysis of Escherichia coli [J].Biochimie,1990,72:191-200.

[8] Mayr U B, Haidinger W, et al. Bacterial ghosts as an oral vaccine:a single dose of Escherichia coli O157: H7 bacterial ghosts protects mice against lethal challenge[J]. Infection and Immunity,2005,73:4810-4817.

[9]JALAVA K,EKO F O,RIEDMANN E,et al.Bacterial ghosts as carrier and targeting systems for mucosal antigen delivery[J]. Expert Rev Vaccines,2003,2(1):45-51.

[10]MAYR U B,WALCHER P,AZIMPOUR C,et al.Bacterial ghosts as antigen delivery vehicles [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2005, 57(9): 1381-1391.

[11]Haidinger W,Mayr U B,Szostak M P,et al. Escherichia coli ghost production by expression of lysis gene E and Staphylococcal nuclease[J].Applied&Environmental Microbiology,2003,69(10):6106-6113.

[12]董洪亮，于圣青，韩先干，等.λpL/pR-cI857温控系统的改造及其对大肠杆菌菌蜕制备的影响[J].生物工程学报，2012，28（12）：1423-1430.

The Preparation of bovine pathogenic Escherichia coli Ghosts

Wang Shixia,Chang Chunlong,Zhai Junjun,Ni Hongbo*
(Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

Preparation bovine E.coli bacterial ghost,the as carrier vaccine and lay the foundation.The cleavage of plasmid PHH43-E electro transformed into bovine Escherichia coli,and by the change of temperature induced bacterial lysis,namely the at 37℃ for growth to logarithmic growth phase,then 42℃ for heat induced.The temperature induced cleavage of plasmid expression can be the cell wall lysis,forming bacteria ghosts,that were prepared bacterial ghosts successfully.

Cattle;Pathogenic Escherichia coli;Bacterial shadow;Preparation

S852.61 < class="emphasis_bold"> 文献标识码：B

B

1672-9692(2016)08-0006-04

2016-07-01

王士霞（1990-），女，黑龙江人，在读硕士，研究方向为分子细菌学与免疫学。

倪宏波（1972-），男，黑龙江人，教授，博士生导师，主要从事分子细菌学和免疫学研究。