Integrin β1对胃癌细胞SGC7901多药耐药性的影响

邵 棋， 曹 斐， 李 梅， 张 艳

(1南通大学附属医院肿瘤化疗科，江苏 南通 226001； 2苏州市立医院北区肿瘤内科，江苏 苏州 215008)

Integrin β1对胃癌细胞SGC7901多药耐药性的影响

邵 棋1， 曹 斐2△， 李 梅1， 张 艳1

(1南通大学附属医院肿瘤化疗科，江苏 南通 226001；2苏州市立医院北区肿瘤内科，江苏 苏州 215008)

目的： 探究整合素β1(integrin β1)对胃癌多药耐药性的影响及可能的作用机制。方法:Western blot法及qPCR实验检测胃癌细胞株SGC-7901及胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP中integrin β1的表达情况。采用integrin β1反义寡核苷酸转染，敲减胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP中integrin β1的表达，CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot法检测integrin β1、Bcl-2/Bax、cleaved caspase-3/caspase-3、细胞色素C(Cyt-C)和p-AKT/AKT的蛋白水平。结果:耐药细胞株SGC7901/DDP中integrin β1的mRNA及蛋白表达水平均明显高于亲本细胞株；并且在亲本细胞株SGC7901中加入顺铂、长春新碱及5-氟尿嘧啶等化疗药物刺激后，integrin β1的蛋白表达水平明显升高。敲减integrin β1的表达可诱导胃癌耐药细胞SGC7901/DDP的凋亡，增加细胞对化疗药物的敏感性；此外下调Bcl-2/Bax、p-AKTSer473和p-AKTThr308的蛋白水平，同时促进线粒体Cyt-C的释放，上调cleaved caspase-3的蛋白水平。结论:敲减胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP的integrin β1表达可恢复细胞对化疗药物的敏感性，促进细胞经线粒体路径的凋亡，其机制可能与抑制AKT的磷酸化，阻断该信号通路有关。

整合素β1； 胃癌； 多药耐药性； 细胞凋亡； AKT

胃癌是一种常见的消化系统肿瘤。随着认知及科技的发展，目前针对胃癌的治疗手段如放化疗、手术治疗及靶向分子疗法都有了长足的进展，但其发病率及死亡率仍然居高不下，特别是肿瘤细胞耐药性的出现，大大降低了药物的疗效[1-3]。因此，探讨胃癌多药耐药的相关机制并寻找可以逆转耐药性的潜在靶点，对于提高治疗效果和患者生存率具有重要的临床意义。

肿瘤的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对某一化疗药物产生耐药性之后，会对作用机制相异的其它类抗肿瘤药物产生交叉耐药的现象[4]。研究表明肿瘤细胞多药耐药的产生包括先天性和获得性2种，但获得性耐药在临床上出现的几率较高，且其机制可能有以下几个方面[5-10]：(1) ABC型转运蛋白家族(ATP结合盒转运蛋白，ATP-binding cassette transporter proteins，ABC proteins)介导的药物外排作用增强；(2) DNA损伤修复功能加强；(3) 谷胱甘肽巯基转移酶(glutathioneS-transferase，GST)解毒能力增强或多药耐药基因异常表达；(4) 细胞抗凋亡作用增强；(5) 细胞自噬活性增强及异常的微小RNA(microRNAs，miRNAs)表达等。

整合素β1 (integrin β1)是整合素家族的重要一员，该家族蛋白是介导细胞黏附和信号转导的跨膜糖蛋白，通过传导胞内外的信号，参与调控细胞的增殖、黏附及迁移等过程，与肿瘤的侵袭转移及肿瘤微环境密切相关[11-12]。大量研究发现，在包括胃癌[13]、舌鳞状细胞癌[14]、宫颈鳞癌[15]等多种实体肿瘤中都出现integrin β1的高表达，且与肿瘤的病理分级及恶性程度密切相关；此外有研究表明，integrin β1的异常表达在肿瘤的化疗耐药中起着重要的作用，Deng等[16]的研究提示integrin β1可介导肿瘤血管新生及下游AKT信号通路的活化，进而参与肿瘤EGFR TKI耐药；而Dong等[17]的研究则表示integrin β1可通过与胞外基质的相互作用引起PI3K/AKT的持续活化，进而介导抗凋亡信号的转导。这些研究提示integrin β1在肿瘤多药耐药中可能也发挥一定的作用。但是integrin β1在胃癌多药耐药中的作用并没有明确的阐释。本文通过integrin β1反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)转染技术沉默细胞中内源性integrin β1的表达，研究integrin β1在胃癌细胞多药耐药中的作用及其相关作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料与试剂

胃癌细胞株SGC-7901及胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP购买于中科院上海细胞库；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI-1640培养基及Opti-MEM培养基均购买于Gibco；LipofectamineTM2000、相关转染试剂及SYBR Green I qPCR试剂盒由Invitrogen提供；胞浆线粒体蛋白分离试剂盒购于Thermo；COX IV抗体购于碧云天公司；抗integrin β1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、caspase-3、细胞色素C (cytochrome C, Cyt-C)、AKT、p-AKT、GAPDH及β-actin单克隆抗体购自 Santa Cruz；CCK-8细胞活力分析试剂盒购买于Dojindo；细胞凋亡检测试剂盒购买于凯基公司；顺铂购买于齐鲁制药公司；紫杉醇(paclitaxel, PTX)购买于海南海药股份有限公司；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)购买于上海旭东海普药业有限公司；其余试剂均为国产市售分析纯。

2 方法

2.1 细胞培养 细胞常规培养于含10% FBS 的RPMI-1640培养基中，细胞培养箱的条件设置为37 ℃、饱和湿度、5% CO2。每2 d换液1次，每3～5 d用0.25%胰酶消化、传代。

2.2 实时荧光定量PCR (qPCR)检测integrin β1的mRNA表达 参照操作手册用TRIzol一步法抽提细胞总RNA。取2 μg总RNA行逆转录实验(终体积为20 μL)，采用SYBR Green qPCR方法检测mRNA的表达。Integrin β1的正向引物为5’-AATGAAGGGCGTGTTGGTAG-3’，反向引物为5’-CTGCCAGTGTAGTTGGGGTT-3’；GAPDH作为内参照，正向引物为5’-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3’，反向引物为5’- GGTCATGAGTCCTTCACGATA-3’。PCR反应体系包括1 μL RT逆转录产物，10 μL SYBR Green PCR Master Mix和500 nmol/L正反向引物。采用MyiQ单色实时PCR检测系统(Bio-Rad)。反应参数为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s，40个循环。采用BANK SKAN图像分析系统分析基因的相对表达量。

2.3 细胞化疗药物敏感性的检测 采用CCK-8法检测胃癌细胞化疗药物的半数抑制浓度(IC50)。取对数生长期的细胞以1×108/L密度接种于96孔板中，待细胞长至80%～90%融合时更换无血清培养基同步化12 h，然后加入终浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/L的顺铂、PTX或5-FU，继续培养46 h，加入CCK-8试剂100 μL孵育2 h，测定450 nm波长处的吸光度(A)，计算细胞的生存率。

2.4 反义寡核苷酸转染敲减integrin β1的表达 取对数生长期细胞以1×108/L密度接种于6孔板中，待细胞长至60%～80%融合时进行转染。组别为空白对照(control，Ctrl)组、阴性对照(nonsense oligodeoxynucleotide，NSODN)组和实验组(ASODN组)。将上述寡核苷酸分别溶解于Opti-MEM培养基中，室温静置5 min，为A液；另取LipofectamineTM2000，溶解于Opti-MEM培养基中，室温静置5 min，为B液；轻柔混合A液和B液，室温静置25 min，形成复合体。将复合体加入相应组别的细胞中，室温孵育4 h后更换为正常细胞培养基继续培养48 h。检测转染效率并进行后续实验分析。integrin β1的ASODN序列为 5’-T*G*CAGTAAGCATCCAT*G*T-3’；无意义NSODN序列为 5’-G*C*AACGAGAGAGCCGT*C*G-3’。

2.5 细胞凋亡的检测 流式细胞术检测细胞凋亡情况，将各组细胞消化后1 000×g离心5 min收集细胞，然后加入binding buffer 重悬细胞。向细胞悬液中加入Annexin V-FITC混匀，室温避光静置10 min；然后加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液，室温下避光染色10 min，采用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm；发射波长Em=530 nm。

2.6 Western blot法检测蛋白水平 收集各组蛋白样品，其中胞浆线粒体蛋白的分离依据Thermo的线粒体分离提取试剂盒提供的说明书进行。用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，调整各组蛋白上样量(80 μg)后加入4倍体积的上样缓冲液，98 ℃水浴变性5 min。上样后采用8%的分离胶行SDS-PAGE，而后将蛋白电转至PVDF膜(约90 min)，5%脱脂牛奶室温封闭90 min，加入相应比例的 I 抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤5 min 3次；分别加入相应的抗HRP标记的 II 抗，室温孵育90 min，TBST洗涤10 min 3次。于暗室中将PVDF膜的蛋白面浸入HRP-ECL发光液中激发荧光，压X片、显影并定影。实验结果采用ImageJ灰度分析软件进行蛋白半定量分析。

3 统计学处理

将本组研究涉及数据录入SPSS 13.0标准版统计软件行数据分析，实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用方差分析，各组均数间的两两比较用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 integrin β1的表达与胃癌细胞化疗耐药之间的关系

我们首先检测了胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP及其对照亲本细胞株SGC7901中化疗药物的IC50(表1)，结果证明SGC7901/DDP对不同化疗药物的耐药性明显强于其亲本细胞株。同时我们还检测了这2株细胞中integrin β1的mRNA及蛋白表达情况，如图1所示，耐药细胞株SGC7901/DDP中integrin β1的mRNA及蛋白表达水平均明显高于亲本细胞株；此外，在亲本细胞株SGC7901中，加入低浓度化疗药物刺激后，integrin β1的蛋白表达水平明显升高(图2)，提示integrinβ1的表达可能与胃癌多药耐药性之间存在相关关系。

表1 胃癌细胞对化疗药物的敏感性

Table 1.The sensitivity (IC50) of GC cells to chemotherapeutics (mg/L. Mean±SD.n=6 )

CelllineCisplatinPTX5-FUSGC7901/DDP5.52±0.21*3.67±0.33*4.52±0.46*SGC79010.61±0.020.42±0.030.73±0.05

*P<0.05vsSGC7901.

Figure 1.The relationship between integrin β1 expression and multidrug resistance in the gastric cancer cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsSGC7901 cells.

图1 integrin β1的表达与胃癌细胞多药耐药性之间的关系

Figure 2.The protein expression of integrin β1 was increased in the SGC7901 cells treated with chemotherapeutic agents. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Ctrl).

图2 SGC7901细胞与低浓度化疗药物共培养后，integrin β1的表达升高

2 转染效率的检测

用qPCR和Western blot实验检测胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP转染ASODN后integrin β1的表达情况，结果显示转染integrin β1 ASODN后，细胞中integrin β1的mRNA及蛋白水平明显降低(P<0.05),见图3。

3 敲减integrin β1对耐药细胞株SGC7901/DDP化疗敏感性的影响

为进一步证明integrin β1的表达与胃癌细胞多药耐药之间的相互关系，我们在耐药细胞株SGC7901/DDP中敲减integrin β1，并检测其对化疗药物敏感性的变化，CCK-8实验的结果显示，敲减SGC7901/DDP细胞的integrin β1表达后，细胞对顺铂、紫杉醇及5-FU的敏感性明显增加，差异具有统计学显著性(P<0.05)，见表2。

Figure 3.The expression of integrin β1 in the SGC7901/DDP cells after transfected with integrin β1 ASODN. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Ctrl).

图3 SGC7901/DDP细胞转染integrin β1 ASODN后integrin β1的表达水平

表2 敲减integrin β1可提高耐药细胞SGC7901/DDP对化疗药物的敏感性

Table 2.Knockdown of integrin β1 increased the sensitivity (IC50) of SGC-7901/DDP cells to chemotherapeutics (mg/L. Mean±SD.n=6)

GroupCisplatinPTX5-FUControl5.56±0.213.67±0.324.54±0.46NSODN5.61±0.233.66±0.294.51±0.38ASODN1.89±0.11*1.04±0.09*2.21±0.14*

*P<0.05vscontrol.

4 敲减integrin β1对细胞凋亡的影响

接着我们考察了敲减integrin β1表达对细胞凋亡的影响，结果显示，在SGC7901/DDP细胞中敲减integrin β1之后，早期凋亡率由(17.13±2.43)%增加至(43.29±2.48)%(P<0.05)。而中晚期细胞凋亡/坏死率由(9.37±1.02)%增加至(13.56 ± 2.43)%。抑制integrin β1的表达可明显促进耐药细胞的凋亡，见图4。

5 敲减integrin β1对凋亡相关信号通路的影响

Western blot实验的检测结果显示，敲减SGC7901/DDP细胞的integrin β1表达之后，抑凋亡蛋白Bcl-2及线粒体Cyt-C的表达显著下降，而凋亡蛋白Bax、胞浆Cyt-C和激活型caspase-3的蛋白水平明显增加，提示线粒体凋亡信号通路被激活，见图5。

除此之外，我们还检测了AKT信号通路的磷酸化情况，结果显示，敲减SGC7901/DDP细胞中integrin β1的表达之后，Ser473 和Thr308位AKT的磷酸化水平显著降低，但是对AKT总蛋白的表达没有明显影响，提示敲减integrin β1可抑制耐药细胞中AKT信号通路的磷酸化活化，见图6。

Figure 4.The effect of integrin β1 knockdown on the SGC7901/DDP cell apoptosis analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Ctrl).

图4 敲减integrin β1对SGC7901/DDP细胞凋亡的影响

Figure 5.The effect of integrin β1 knockdown on the mitochondrial apoptosis pathway in the SGC7901/DDP cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Ctrl).

图5 敲减integrin β1 过表达对线粒体凋亡信号通路的影响

讨 论

Integrin β1已被证实是一种重要的参与肿瘤细胞黏附转移的分子，作为一类跨膜蛋白，它还介导了细胞内外信号的转导过程，并与肿瘤获得性耐药的出现密切相关[13,16-17]。我们的研究发现，在胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP中integrin β1的mRNA和蛋白表达水平均显著增加，且低浓度化疗药物刺激可引起SGC7901细胞中integrin β1的表达，提示integrin β1可能参与调控胃癌化疗耐药现象的发生。此外通过转染integrin β1反义寡核苷酸敲减其表达，可提高耐药细胞对化疗药物的敏感性。因此我们认为，integrin β1介导胃癌化疗耐药性的出现。

为进一步了解integrin β1介导胃癌化疗耐药的作用机制，我们检测了耐药细胞SGC7901/DDP敲减integrin β1后细胞的凋亡水平，结果发现，敲减integrin β1可促进SGC7901/DDP的凋亡。由此我们认为，敲减integrin β1提高胃癌耐药细胞的化疗敏感性可能是通过促进耐药细胞的凋亡实现的。细胞的凋亡是一个涉及多条信号通路、调控精细复杂的过程。目前认为细胞的凋亡途径包括死亡受体通路介导的细胞凋亡和线粒体途径介导的细胞凋亡[18-19]。实验中我们发现，integrin β1敲减可促进耐药细胞中促凋亡蛋白Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达；同时促进线粒体细胞色素C的释放，激活死亡蛋白酶caspase家族中的关键效应蛋白分子caspase 3。结果表明，沉默integrin β1提高胃癌耐药细胞的化疗敏感性可能与线粒体凋亡信号通路的激活有关。近来研究表明AKT信号通路也参与调控细胞的凋亡过程[20-21]，故而我们还检测了integrin β1对AKT信号通路的影响，结果表明沉默integrin β1可抑制AKT Ser473及Thr308位点的磷酸化，进而阻断AKT信号通路的活化；但是除AKT磷酸化信号通路之外，是否还有其它信号通路的参与及其具体的调控机制还有待进一步深入的研究。

Figure 6.The effect of integrin β1 knockdown on the activation of AKT. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Ctrl).

图6 敲减integrin β1 过表达对AKT活性的影响

[1] Fu DG. Epigenetic alterations in gastric cancer (Review)[J]. Mol Med Rep, 2015, 12(3):3223-3230.

[2] Hamashima C. Current issues and future perspectives of gastric cancer screening[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(38):13767-13774.

[3] Yu B, Xie J. Identifying therapeutic targets in gastric cancer: the current status and future direction[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2016, 48(1):90-96.

[4] Wu Q, Yang Z, Nie Y, et al. Multi-drug resistance in cancer chemotherapeutics: mechanisms and lab approaches[J]. Cancer Lett, 2014, 347(2):159-166.

[5] Karthikeyan S, Hoti SL. Development of fourth generation ABC inhibitors from natural products: a novel approach to overcome cancer multidrug resistance[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2015, 15(5):605-615.

[6] Li X, Liu W, Wang H, et al. Rap1 is indispensable for TRF2 function in etoposide-induced DNA damage response in gastric cancer cell line[J]. Oncogenesis, 2015, 4:e144.

[7] Rodrigues AS, Dinis J, Gromicho M, et al. Genomics and cancer drug resistance[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2012, 13(5):651-673.

[8] Wang YJ, Li Q, Xiao HB, et al. Chamaejasmin B exerts anti-MDR effectinvitroandinvivovia initiating mitochondria-dependent intrinsic apoptosis pathway[J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9:5301-5313.

[9] Panzarini E, Dini L. Nanomaterial-induced autophagy: a new reversal MDR tool in cancer therapy?[J]. Mol Pharm, 2014, 11(8):2527-2538.

[10]Zhang XL, Shi HJ, Wang JP, et al. MiR-218 inhibits multidrug resistance (MDR) of gastric cancer cells by targeting Hedgehog/smoothened[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(6):6397-6406.

[11]Barkan D, Chambers AF. β1-integrin: a potential therapeutic target in the battle against cancer recurrence[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(23):7219-7223.

[12]Margadant C, Monsuur HN, Norman JC, et al. Mechanisms of integrin activation and trafficking[J]. Curr Opin Cell Biol, 2011, 23(5):607-614.

[13]He XJ, Tao HQ, Hu ZM, et al. Expression of galectin-1 in carcinoma-associated fibroblasts promotes gastric cancer cell invasion through upregulation of integrin β1[J]. Cancer Sci, 2014, 105(11):1402-1410.

[14]Hong YM, Gan WG, Xu ZH. Significance of the expression of integrin β1, VEGF and MVD in hypopharyngeal squamous cell carcinoma[J]. Genet Mol Res, 2014, 13(3):6455-6465.

[15]Zhan P, Liu L, Liu B, et al. Expression of integrin β1 and its significance in squamous cell carcinoma of the cervix[J]. Mol Med Rep, 2014, 9(6):2473-2478.

[16]Deng QF, Su BO, Zhao YM, et al. Integrin β1-mediated acquired gefitinib resistance in non-small cell lung cancer cells occurs via the phosphoinositide 3-kinase-dependent pathway[J]. Oncol Lett, 2016, 11(1):535-542.

[17]Dong Y, Xie X, Wang Z, et al. Increasing matrix stiffness upregulates vascular endothelial growth factor expression in hepatocellular carcinoma cells mediated by integrin β1[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 444(3):427-432.

[18]Pistritto G, Trisciuoglio D, Ceci C, et al. Apoptosis as anticancer mechanism: function and dysfunction of its modulators and targeted therapeutic strategies[J]. Aging (Albany NY), 2016, 8(4):603-619.

[19]Siddiqui WA, Ahad A, Ahsan H. The mystery of BCL2 family: Bcl-2 proteins and apoptosis: an update[J]. Arch Toxicol, 2015, 89(3):289-317.

[20]周 俊， 曹 江， 孟凡静， 等. Akt特异性抑制剂MK2206诱导U937及RS4;11细胞凋亡及其机制[J]. 中国实验血液学杂志, 2015, 23(3):627-632.

[21]Zhang X, Liang D, Lian X, et al. Berberine activates Nrf2 nuclear translocation and inhibits apoptosis induced by high glucose in renal tubular epithelial cells through a phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent mechanism[J]. Apoptosis, 2016, 21(6):721-736.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Effect of integrin β1 on multidrug resistance in gastric cancer SGC-7901 cells

SHAO Qi1, CAO Fei2, LI Mei1, ZHANG Yan1

(1DepartmentofOncochemotherapy,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China;2DepartmentofOncology,NorthDistrictofSuzhouMunicipalHospital,Suzhou215008,China.E-mail:drcaofei@126.com)

AIM: To study the effect of integrin β1 on multidrug resistance in gastric cancer and its possible mechanisms. METHODS: The expression of integrin β1 at mRNA and protein levels in the SGC-7901 cells and SGC-7901/DDP cells was determined by qPCR and Western blot. The expression of integrin β1 in the SGC-7901/DDP cells was silenced by antisense oligodeoxynucleotide. The cell viability was detected by the CCK-8 assay, the cell apoptosis were analyzed by flow cytometry, and the protein levels of integrin β1, Bcl-2/Bax, cleaved caspase-3/caspase-3, cytochrome C (Cyt-C) and p-AKT/AKT were determined by Western blot.RESULTS: The expression of integrin β1 at both mRNA and protein levels was significantly upregulated in SGC-7901/DDP cells. The expression of integrin β1 was increased in SGC-7901 cells treated with chemotherapeutic agents such as cisplatin, paclitaxel and 5-fluorouracil. Knockdown of integrin β1 induced apoptosis of SGC-7901/DDP cells with an increased sensitivity to the chemotherapeutic agents. Meanwhile, knockdown of integrin β1 downregulated the protein levels of Bcl-2/Bax, p-AKTSer473and p-AKTThr308, while promoted the release of Cyt-C and upregulated the protein level of cleaved caspase-3. CONCLUSION: Knockdown of integrin β1 increases the sensitivity of SGC-7901/DDP cells to the chemotherapeutic agents, and promotes the cell apoptosis via mitochondrial apoptosis pathway. The mechanism may be related to the attenuation of AKT pathway by inhibiting phosphorylations of AKT at Ser473 and Thr308.

Integrin β1; Gastric cancer; Multidrug resistance; Apoptosis; AKT

1000- 4718(2016)12- 2233- 06

2016- 07- 05

2016- 09- 27

R730.23; R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.018

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0512-62363011； E-mail： drcaofei@126.com