陕北地区秦川牛及其多个杂交后代群体的遗传多样性

2017-01-03闫海龙马志杰陈生会谢银禄昝林森

西北农业学报 2016年12期

闫海龙，马志杰，成功，陈生会，王斌，谢银禄，屈雷，昝林森

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.榆林学院生命科学研究中心，陕西榆林 719000；>3.青海省畜牧兽医科学院,西宁 810016；4.神木县畜牧兽医技术推广站，陕西神木 719300；5.青海省格尔木市畜牧兽医站，青海格尔木 816000)

闫海龙1,2，马志杰3，成功1，陈生会4，王斌4，谢银禄5，屈雷2，昝林森1

为了解陕北地区黄牛的遗传多样性及遗传背景，采用直接测序技术对55头饲养在陕北榆林地区的秦川牛及其多个杂交后代群体的线粒体DNA D-loop区826 bp序列进行测定。结果表明，榆林地区黄牛D-loop 区序列A+T平均含量为61.5%，G+C含量38.5%；共检测到33种单倍型和84个变异位点，核苷酸多样度(π)为0.021 43,单倍型多样度(h)为0.970，表明陕北榆林地区的黄牛具有丰富的遗传多样性。NJ法聚类结果显示，该地区的黄牛品种或群体有2个母系起源。

陕北地区；秦川牛；线粒体D-loop；遗传多样性

黄牛作为牛属遗传资源宝库中的一部分，具有耐粗饲、耐寒、抗病力强、肉味浓郁而不腥臊等优点，在中国分布广泛。由于国内一些地方存在盲目引进外来品种杂交的现象，造成本地黄牛品种的数量不断减少，使宝贵的基因资源丢失。因此，对国内黄牛的品种资源进行调查与研究，对于黄牛品种的合理保护与利用都是一件必要的工作。

目前，许多研究都集中在黄牛的起源、演化和分类方面，并且取得大量的成果。《中国牛品种志》中按地理分布区域将中国的黄牛品种划分为北方黄牛、中原黄牛和南方黄牛[1]。通过分析血液蛋白多态性发现中国北方牛属于普通牛，而且北方牛群体品种内杂合度较低，而海南牛可能是另外一个瘤牛的发源地[2]。通过Y染色体多态性研究发现，北方黄牛受普通牛影响大，南方黄牛受瘤牛影响大，而中原黄牛受普通牛和瘤牛的影响均等[3]。线粒体D-环高变区序列( mtDNA D-loop hypervariable segment)在不同种间、种内不同群体间具有广泛多态性，可以作为一种可靠的遗传标记。根据mtDNA D-loop序列变异，被广泛用于研究品种或群体的起源、演化和分类。赖松家等[4-5]研究报道，中国北部和西部只有4.3%的牛属于瘤牛型，中原地区有39.3%的牛属于瘤牛型，南部和西南部牛有44%属于瘤牛型。雷初朝等[6-7]对8个中国黄牛品种mtDNA序列中D-loop区全序列进行多态性研究，发现中国北方黄牛有三大母系起源，分别为普通牛、瘤牛和不明身份的母系。

陕西北部榆林地区的黄牛处于蒙古牛饲养区和秦川牛饲养区的交界区，因其较强的适应性和产肉性能已成为当地主要的畜种资源之一。但迄今为止，很少有学者对这一地区黄牛的遗传资源状况进行研究，许多地方品种资源受到外来品种侵袭，导致当地黄牛生产性能下降，因此，调查陕北榆林地区黄牛的母系遗传背景和遗传结构，为选育工作提供理论依据。本研究采用mtDNAD-loop 序列作为分子标记，对榆林地区的黄牛母系遗传背景进行研究，旨在为研究中国黄牛的起源演化和遗传多样性提供基础资料，对指导中国地方黄牛定向选育及牛种遗传资源保护具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以陕北榆林地区秦川牛及其杂交后代为研究对象，分别为：秦川牛(QCH)33 头，秦川牛(母本)与安格斯杂交后代(QCHAGS)12 头，秦川牛(父本)与蒙古牛杂交后代(QCHZM)7 头，秦川牛(父本)与本地黄牛杂交后代(QCHBD)3 头，共计采集55 头黄牛血样，各10 mL左右。血液加抗凝剂带回实验室后-80 ℃保存，备用。

1.2 试验方法

按照常规的酚-氯仿法提取牛的总DNA[8]，用紫外分光光度计和凝胶电泳双重检测其质量浓度和纯度，调整终质量浓度到50～100 ng/μL，备用。线粒体DNA D-loop 扩增引物为黄牛的特异性引物，引物设计参照Loftus等[9]和Wu等[10]研究。上游引物为： 5′-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3′; 下游引物为: 5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。引物由上海生工技术服务有限公司合成。

PCR 扩增体系总体积为50 μL，反应条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，30 个循环；最后68 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。PCR 产物用10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及质量浓度。每个样品取5 μL用于检测，对于扩增效果良好且足量的样品，用Omega 公司(美国) 回收试剂盒对其剩余的45 μL PCR 产物进行纯化与回收。回收后的PCR 产物由上海生工技术服务有限公司测序。

1.3 数据处理

用Chromas 2.33 ( http://www.Technelysium.com. Au/chromas.html)软件对原始序列进行编辑；用BioEdit 7.0.9软件中的Clustal Wmultiple alignment程序将测定的秦川牛及其杂交后代相应序列进行多序列比对；采用DnaSP 4.10.3 (http://www.ub:Es/dnasp ) 软件进行序列多态位点、单倍型多样性和核苷酸多样性分析，确定核苷酸变异类型、单倍型数目和类型，计算单倍型多样度(h)和核苷酸多样度(π)[11]；用MEGA Ver4.0 软件统计序列的长度和碱基组成，以邻接法(Neighbor-Joining，NJ) 构建品种或群体间聚类关系。

2 结果与分析

2.1 序列变异

通过对陕北榆林地区秦川牛及其杂交后代4个群体55个个体D-loop 区826 bp序列进行统计分析，结果表明，A+T碱基含量平均为61.5%，G+C含量平均为38.5%，说明榆林地区黄牛D-loop区富含A+T碱基，核苷酸组成存在一定的偏倚性。

以本研究中的单倍型1作为标准(图1)，共发现转换和颠换位点84 处，占分析序列总长度的10.17%，其中27 处位点均为两核苷酸变异的单一多态位点，约占3.27%；52处位点均为两核苷酸变异的简约信息位点，约占6.29%；5处位点均为三核苷酸间变异的简约信息位点；未发现四核苷酸间的变异。序列间检测到3种突变类型: 即转换、颠换及转换/颠换共存。其中转换71次(占75.53%)：A与G的转换28次，占29.79%；C与T的转换43次，占45.74%；颠换23次(占24.47%)： A与C的转换7次，占7.45%；G与T的转换2次，占2.13%；A与T的颠换9次，占9.57%；G与C的颠换5次，占5.22%。

2.2 单倍型多样度及系统发育分析

对陕北榆林地区黄牛的mtDNA D-loop区多序列比对分析后发现图1，确定33种单倍型。其中单倍型Hap1和Hap32各有6个个体共享，为优势单倍型。分别有3个个体共享单倍型Hap7和Hap33，而单倍型Hap2、Hap4、Hap6、Hap9、Hap18、Hap19、Hap23和Hap28各有2个个体共享，其余个体均拥有各自独立的单倍型(即Hap3、Hap5、Hap8、Hap10-17、Hap20-22、Hap24-27 和Hap29-31)。序列平均核苷酸差异K为17.097 64，π为0.021 43，h为0.970。

以水牛(Genbank No.: JN632607)相应序列作为外群，以陕北榆林地区黄牛mtDNA D-loop序列构建系统发育树。从图2可以看出，陕北榆林地区黄牛明显分为2个分支，即Clade A和Clade B，说明陕北榆林地区黄牛可能有2个母系来源。

图1 陕北榆林地区黄牛mtDNAD-loop区的33 种单倍型

3 讨论

近年来，动物mtDNA研究的热点之一是mtDNA D-loop区序列的核苷酸变异分析，国外有关牛mtDNA D-loop区序列的核苷酸变异报道较多[12-15]。在国内研究中，雷初朝等[16]研究发现22 头中国黄牛个体mtDNA D-loop区存在19种单倍型，A+T平均含量为61.65%，G+C平均含量为38.35%。本研究对陕北榆林地区秦川牛及其杂交后代的mtDNA D-loop区826 bp序列分析发现：共有33 种单倍型，A+T的平均含量为61.5%，G+C的平均含量为38.5%；榆林地区黄牛mtDNA D-loop区序列的结构特征和核苷酸组成与前人研究[16]结果基本一致，说明本次测序的结果是正确可靠的，另一方面也说明榆林本地的黄牛mtDNA D-loop区与中国其他地区的黄牛具有相似的结构特征和组成。然而，本研究并未对mtDNA D-loop区全序列进行测序，因此关于序列长度是否发生变异有待进一步分析。

通常在线粒体基因组DNA进化过程中主要以碱基替换为主，插入和缺失现象较少[17]，碱基替换又分为转换和颠换2种形式，而且发生转换的频率要远远高于颠换。本研究，共发现3 种变异类型: 即转换、颠换及转换/颠换共存。检测到的84 处核苷酸变异位点中，其中转换71 个、颠换23 个，说明转换率明显高于颠换率，该研究结果与哺乳动物的mtDNA D-loop区进化特点相同[6]。Loftus等[9]对欧洲牛、印度瘤牛及非洲牛共计13 个品种的D-loop 区全序列分析发现：共存在24种单倍型，63个核苷酸变异位点，其中转换59个，颠换1个，2个插入/缺失，1个Poly(C)区长度变异。雷初朝等[16]的研究表明，中国8个黄牛品种22个个体D-loop区全序列中，存在66个核苷酸位点发生突变，其中转换54个，颠换4个，插入5个，缺失2个，转换与颠换共存位点1个。本研究发现，陕北榆林地区黄牛D-loop 区序列的核苷酸替换数目稍微高于欧洲牛、印度瘤牛、非洲牛，以及中国其他地区黄牛，但是本研究中并未发现插入和缺失，这可能与样本数量、测序长度或品种差异有关。另外，本研究在陕北榆林地区秦川牛及其杂交后代中发现5 处三核苷酸间变异的简约信息位点，有待进一步研究。

图2 陕北榆林地区黄牛mtDNAD-loop序列NJ分子系统树

衡量群体DNA遗传多样性的指标，主要是单倍型多样度(h)和核苷酸多样度(π)，单倍型多样度(h)是指样本中随机抽取的序列互不相同的频率，单倍型多样度(h)高的群体说明其遗传多样性高，而碱基的多样性和结构的多样性决定核苷酸多样度(π)。刘若余等[18]研究表明贵州关岭黄牛D-loop区全序列的单倍型多样度(h)为0. 909，核苷酸多样度(π)为2. 29%。周艳等[19-20]发现云南昭通黄牛的单倍型多样度(h)为0. 952± 0. 096，核苷酸多样度(π)为2. 504%；而南方黄牛品种单倍型多样度(h)为0.750±0.074，核苷酸多样度(π)为2.25%。在本研究中，mtDNA D-loop区部分序列的单倍型多样度(h)为0.970，核苷酸多样度(π)为2.143%，与前人对其他黄牛品种的遗传多样性评估基本相似，表明陕北榆林地区的黄牛具有丰富的遗传多样性。但是魏磊等[21]根据mtDNA的MHC基因数据报道，发现皖北黄牛品种单倍型多样度(h) 为0.602～0.617，π为0.012～0.019，遗传多样性比较贫乏；雷初朝等[16]发现中国8个黄牛品种的π值为0.55%～5.39%；此外，Loftus研究表明欧洲牛品种、非洲牛品种和印度瘤牛品种的π为0.11%～0.92%[9]。上述研究表明，各牛品种π具有一定程度的差异，其主要原因认为是普通牛和瘤牛祖先分化较早，而中国黄牛的一些品种同时具有瘤牛血统和普通牛血统混合起源，序列间的变异较大，故所测π值较高。

长期以来，黄牛作为世界上最有经济价值的家畜之一，其起源进化和遗传多样性一直是研究的热点和育种工作的关键。通过系统发育分析发现，陕北榆林地区的黄牛群体明显分为2支，说明其可能有两个母系起源，但是究竟这2个母系起源于何处，还有待进一步研究。

Reference：

[1] 中国牛品种志编写组.中国牛品种志[M].上海:上海科学技术出版社,1988.

COMPILE GROUP OF THE CATTLE BREED RECORDS.The Cattle Breed Records [M].Shanghai:Shanghai Science and Technology Press,1988 (in Chinese).

[2] 陈幼春,常洪.编制中国牛种体型外貌调查提纲的探讨[J].中国黄牛,1987(3):75-77.

CHEN Y CH,CHANG H.To investigate compile the outline for investigation of size appearance of China’s cattle [J].ChinaCattleScience,1987(3):75-77 (in Chinese).

[3] 雷初朝,陈宏,胡沈荣.Y染色体多态性与中国黄牛起源和分类研究[J].西北农业学报,2004,4(4):43-47.

LEI CH ZH,CHEN H,HU SH R.Studies on Y chromosome polymorphism and the origin and classification of Chinese yellow cattle [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2000,4(4):43-47(in Chinese with English abstract).

[4] 赖松家,刘延鑫,李学伟,等.四川黄牛品种线粒体 DNA 遗传多样性研究[J].畜牧兽医学报,2005,36 (9):887-892.

LAI S J,LIU Y X,LI X W,etal.Study on mitochondrial DNA genetic polymorphism of cattle breeds in Sichuan province [J].ChineseJournalofAnimalandVeterinarySciences,2005,36 (9):887-892(in Chinese with English abstract).

[5] LAI S J,LIU Y P,LIU Y X,etal.Genetic diversity and origin of Chinese cattle revealed by mtDNA D-loop sequence variation [J].MolecularPhylogeneticsandEvolution,2006,38(1):146-154.

[6] 雷初朝.中国四个畜种 (黄牛,水牛,牦牛,家驴) 线粒体 DNA 遗传多样性研究[D].陕西杨凌:西北农林科技大学,2002.

LEI CH ZH.The study of mtDNA genetic diversity in four Chinese lives tocks [D].Yangling Shaanxi:Northwest A&F University,2002(in Chinese with English abstract).

[7] LEI CH ZH,CHEN H,ZHANG H C,etal.Origin and phylogeographical structure of Chinese cattle [J].AnimalGenetics,2006,37(6):579-582.

[8] GREEN M R,SAMBROOK J.Molecular Cloning:ALaboratory Manual [M].New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012.

[9] LOFTUS R T,MACHUGH D E,BRADLEY D G,etal.Evidence for two independent domestications of cattle [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1994,91(7):2757-2761.

[10] WU J,SMITH R K,FREEMAN A E,etal.Sequence heteroplasmy of D-loop and rRNA coding regions in mitochondrial DNA from Holstein cows of independent maternal lineages [J].BiochemicalGenetics,2000,38(9/10):323-336.

[11] ROZAS J,ROZAS R.DnaSP version 3:an integrated program for molecular population genetics and molecular evolution analysis[J].Bioinformatics,1999,15(2):174-175.

[12] TROY C S,MACHUGH D E,BAILEY J F,etal.Genetic evidence for Near-Eastern origins of European cattle [J].Nature,2001,410(6832):1088-1091.

[13] MANNEN H,MORIMOTO M,OYAMA K,etal.Identification of mitochondrial DNA substitutions related to meat quality in Japanese Black cattle[J].JournalofAnimalScience,2003,81(1):68-73.

[14] DECKER J E,MCKAY S D,ROLF M M,etal.Worldwide patterns of ancestry,divergence,and admixture in domesticated cattle[J].PLoSGenet,2014,10(3):e1004254.

[15] OLIVIERI A,GANDINI F,ACHILLI A,etal.Mitogenomes from Egyptian cattle breeds:new clues on the origin of haplogroup Q and the early spread of Bos taurus from the near east[J].PloSone,2015,10(10):e0141170.

[16] 雷初朝,陈宏,杨公社,等.中国部分黄牛品种mtDNA遗传多态性研究[J].遗传学报,2004,31(1):57-62.

LEI CH ZH,CHEN H,YANG G SH,etal.Study on mitochondrial DNA genetic diversity of some cattle breeds in China [J].JournalofGeneticsandGenomics,2004,31(1):57-62(in Chinese with English abstract).

[17] 黄原.分子系统学-原理、方法及应用[M ].北京:中国农业出版社,1998.

HUANG Y.Molecular Systematics-Principles,Methods and Applications [M].Beijing:China Agriculture Publisher,1998(in Chinese).

[18] 刘若余,杨公社,夏先林,等.贵州关岭黄牛线粒体DNA D-loop区全序列遗传多样性分析[J].山地农业生物学报,2005,24(1):33-36.

LIU R Y,YANG G SH,XIA X L,etal.Analysis on the genetic diversity of mitochondrial DNA D-loop region complete sequence of Guanling cattle in Guizhou province [J].JournalofMountainAgricultureandBiology,2005,24(1):33-36(in Chinese with English abstract).

[19] 周艳,陈宏,贾善刚,等.云南昭通黄牛mtDNA D-loop区遗传变异分析[J].中国牛业科学,2007,33(6):38-41.

ZHOU Y,CHEN H,JIA SH G,etal.Study on mtDNA D-loop region genetic diversity in Zhaotong cattle [J].ChinaCattleScience,2007,33(6):38-41(in Chinese with English abstract).

[20] 周艳,陈宏,贾善刚,等.中国南方部分黄牛品种mtDNA D-loop区的遗传变异与分类分析[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2008,36(5):7-11.

ZHOU Y,CHEN H,JIA SH G,etal.The analysis of genet ic variat ion of mtDNA D-loop region and phylogenesis on some southern Chinese cattle breeds [J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition),2008,36 (5):7-11(in Chinese with English abstract).

[21] 魏磊,杜永才,王玉民.皖北黄牛MHC基因遗传多样性及分子系统关系[J].安徽农业科学,2011,39(14):8648-8649,8666.

WEI L,DU Y C,WANG Y M.Genetic diversity ofMHCgene and molecular phylogeny in Wanbei cattle [J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences,2011,39(14):8648-8649,8666(in Chinese with English abstract).

(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Genetic Diversity of Qinchuan Cattle and Its Hybrids in the Northern Shaanxi Province

YAN Hailong1,2,MA Zhijie3,CHENG Gong1,CHEN Shenghui4, WANG Bin4,XIE Yinlu5,QU Lei2and ZAN Linsen1

(1.College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 2.Life Science Research Center,Yulin University,Yulin Shaanxi 719000,China; 3.Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine,Xining 810016,China; 4.Extension Station of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Shenmu County,Shenmu Shaanxi 719300, China；5.Station of Animal Husbandry and Veterinary of Golmud City in Qinghai Province,Golmud Qinghai 816000,China)

To explore the genetic diversity and genetic background of Qinchuan cattle and its hybrids in Northern Shaanxi Province,826 bp mtDNA D-loop sequences from 55 Qinchuan cattle and its hybrids were sequenced and analyzed. The results showed that the content of A+T bases was 61.5%,while the percentage of G+C bases was 38.5%. We also found 84 mutation sites which identified 33 haplotypes.The nucleotide diversity was 0.021 43 and the haplotype diversity was 0.970,which indicated that abundant mitochondrial genetic diversity exists in cattle from Yulin region in Northern Shaanxi province.Phylogenetic analysis by using the NJ method showed that all the sequences were clustered into two major clades. The results indicated that there were two maternal origins to Qinchuan cattle and its hybrids in Yulin region.

The Northern Shaanxi； Qinchuan cattle；mtDNA D-loop；Genetic diversity

YAN Hailong,male,lecturer,doctoral student. Research area: livestock breeding and reproduction. E-mail: ylhailong@126.com

ZAN Linsen,male,professor,Ph.D,doctoral supervisor. Research area: genetics,breeding and reproduction of beef cattle and dairy cattle. E-mail: zanlinsen@163.com

2016-03-22

2016-04-29

国家“863”计划(2013AA102505)；国家肉牛牦牛产业技术体系(CARS-38)；陕西省科技统筹创新工程计划(2014KTZB02-02)。

闫海龙，男，讲师，博士研究生，主要从事家畜育种与繁殖研究。E-mail：ylhailong@126.com

昝林森，男，教授，博士，博士生导师，主要从事肉牛奶牛遗传育种与繁殖研究。E-mail：zanlinsen@163.com

日期：2016-12-12

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1114.002.html

S813.1

1004-1389(2016)12-1749-06

Received 2016-03-22 Returned 2016-04-29

Foundation item The National High-Technology Research and Development Program(“863” Program) (No.2013AA102505); National Beef Cattle Industrial Technology System (No.CARS-38)；Innovation Project of Science and Technology of Shaanxi (No. 2014KTZB02-02).