大蒜素对致死型约氏疟原虫鼠疟模型CD4+活化/凋亡T细胞的影响

冯永辉， 朱晓彤， 单风平， 曹雅明*

(1.中国医科大学附属第一医院 检验科，辽宁 沈阳 110001;2.中国医科大学基础医学院 免疫学教研室，辽宁 沈阳 110122)

大蒜素对致死型约氏疟原虫鼠疟模型CD4+活化/凋亡T细胞的影响

冯永辉1,2， 朱晓彤2， 单风平2， 曹雅明2*

(1.中国医科大学附属第一医院 检验科，辽宁 沈阳 110001;2.中国医科大学基础医学院 免疫学教研室，辽宁 沈阳 110122)

探讨大蒜素对致死型约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii17XL，P.y17XL)感染BALB/c小鼠T细胞免疫应答的影响。P.y17XL感染后第0～2天每日口服给予不同浓度大蒜素(3 mg/kg或9 mg/kg)处理；动态监测各组小鼠原虫血症水平和生存期；感染后第0天、第3天和第5天无菌提取小鼠脾细胞，FACS检测小鼠活化T细胞(CD4+CD69+)、凋亡CD4+T细胞(7AAD-Annexin V+)数量变化；ELISA检测脾细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α的水平。结果显示：与NC组相比，大蒜素处理组能降低感染小鼠的原虫血症水平，延长生存期。大蒜素处理能提高感染小鼠活化T细胞的数量，降低凋亡T细胞数量，并能提高脾细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α的水平。大蒜素能在感染早期促使宿主建立有效的Th1免疫应答，从而抑制红内期P.y17XL疟原虫感染进程。

致死型约氏疟原虫；大蒜素；免疫应答；T细胞

2014年WHO全球疟疾报告指出[1]：目前全球有33亿人受到疟疾威胁，其中1.98亿人发病，约58万人死亡，绝大多数是5岁以下儿童。为根除疟疾，人们不断探究新的策略，虽然疟疾疫苗的研究在不断深入，但受制于疟疾保护性免疫应答的研究，尤其是流行区患者存在反复感染，迄今仍未研发出完全有效的疟疾疫苗，亟待抗疟药物的研发。很多天然植物具有免疫调节活性，大蒜是最古老的药用植物之一，早在5 000年前就被用于治疗人类疾病。大蒜具有多种药理作用[2-3]，如抗菌、抗氧化和抗肿瘤活性。大蒜素是新鲜大蒜在切割过程中由蒜氨酸转化生成[4]。最近研究表明大蒜素能抑制原虫增殖与半胱氨酸蛋白酶抑制效应有关[5]，但关于大蒜素对疟疾感染的免疫调节作用研究甚少。本研究利用BALB/c小鼠感染致死型约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii17XL，P.y17XL)来研究大蒜素对疟疾免疫调节的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 6～8周龄雌性BALB/c小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心。P.y17 XL，日本爱嫒大学分子寄生虫学教研室惠赠。

1.1.2 主要试剂 大蒜素肠溶胶囊购自湖北金龙福药业有限公司，用无水乙醇配制成10 mg/mL储存液，使用前用PBS稀释成1 mg/mL；抗体FITC-ant-CD4(clone GK1.5)、PE-anti-CD69(clone H1.2F3)和凋亡试剂盒(Annexin V和7AAD)均购自BD PharMingen；IFN-γ和TNF-α ELISA试剂盒购自R&d公司。

1.2 方法

1.2.1 实验模型建立及处理 雌性BALB/c小鼠随机分为4组：正常组(Normal)、正常对照组(NC)、3 mg/kg大蒜素组(3 mg/kg)和9 mg/kg大蒜素组(9 mg/kg)。经腹腔感染分别感染1×106P.y17XL寄生红细胞，大蒜素处理组在感染后第0～2天每天口服给予3 mg/kg或9 mg/kg，NC组给予等量PBS，Normal组小鼠不做任何处理。感染不同时间小鼠尾静脉取血，镜检计数每1 000个红细胞中感染P.y17XL的红细胞，作为感染率(原虫血症)，并每日观察生存率。

1.2.2 脾脏流式细胞术 无菌取出感染后第3天、第5天小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解红细胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640调整脾细胞终浓度为1×107/mL。在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1 mL，再加入抗-CD4-FITC单克隆抗体、抗-CD69-PE单克隆抗体进行表面染色。离心去上清后，用0.5 mL细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。进行凋亡T细胞检测时，先用抗-CD4-FITC单克隆抗体进行染色，然后按照凋亡T细胞试剂盒说明书进行染色，流式细胞仪进行检测。

1.2.3 IFN-γ、TNF-α定量检测 用ELISA试剂盒分别检测脾细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α的分泌水平。酶标仪测定450 nm处OD值。实验操作按照试剂盒说明书进行，以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoftMax Pro 4.3.1Ls软件分析，计算细胞因子含量(pg/mL)。

1.2.4 统计学分析 使用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，标本采用独立样本t检验比较分析组内和组间均值差异，采用Kaplan-Meyer方法进行生存期分析。P<0.05为显著差异。

2 结果与分析

2.1 大蒜素处理对P.y17XL感染小鼠原虫血症和生存期的影响

如图1所示，BALB/c小鼠在感染P.y17XL之后，原虫血症不断升高，在感染后第5天达到峰值，随后下降，NC组小鼠在感染后第4～6天全部死亡。而大蒜素处理组(3 mg/kg和9 mg/kg)小鼠的原虫血症水平上升较为缓慢，在第5天达到峰值，之后下降，在感染后第6天开始死亡，分别于第11天和第14天全部死亡(与对照组相比，P<0.05)。

2.2 大蒜素处理对P.y17XL感染小鼠活化T细胞的影响

P.y17XL感染会促使小鼠脾脏活化T细胞(CD4+CD69+)增殖，在感染后第3天，大蒜素处理组小鼠脾脏中的活化T细胞比例高于NC组小鼠，同时活化T细胞数量也显著高于NC组(P< 0.05)。在感染后第5天大蒜素处理组小鼠脾脏中的活化T细胞比例高于NC组小鼠，同时活化T细胞数量也显著高于NC组(P< 0.05)。

图1 大蒜素处理对P.y 17XL感染小鼠原虫血症和生存期的影响Fig.1 The effect of Allicin treatment on the parasitemia and survival time of BALB/c mice infected with P.y 17XLA：大蒜素处理对原虫血症的影响；B：大蒜素处理对生存期的影响; *:与NC组相比，P< 0.05 A: The effect of Allicin treatment on the parasitemia; B: The effect of Allicin treatment on the survival time; *:P< 0.05 compared with NC group

图2 大蒜素处理对P.y 17XL感染小鼠活化T细胞的影响Fig.2 The effect of Allicin treatmenton the proliferation of activated T cellsin BALB/c mice infected with P.y 17XLA：不同天数的流式图；B：活化T细胞的绝对数; *:与Normal组(正常鼠)相比，P<0.05; #:与NC组相比，P<0.05 A: Flow cytometry figures on different days; B: Absolute numbers of activated T cells; *:P<0.05 compared with Normal group (normal mice); #:P<0.05 compared with NC group

2.3 大蒜素处理对P.y17XL感染小鼠CD4+凋亡T细胞的影响

P.y17XL感染会诱导小鼠脾脏CD4+T细胞的凋亡(7AAD-Annexin V+)，凋亡T细胞数量随着感染进程不断增加[6]。在感染后第3天，大蒜素处理组小鼠脾脏的CD4+T细胞凋亡比例显著低于NC组(P<0.05)，同时凋亡T细胞的数量也显著低于NC组(P<0.05)。与NC组相比，在感染后第5天，大蒜素处理组小鼠的凋亡T细胞比例和数量均显著降低(P<0.05)。

图3 大蒜素抑制P.y 17XL感染小鼠CD4+T细胞的凋亡Fig.3 The effect of Allicin treatment on the apoptosis of CD4+ T cells in BALB/c mice infected with P.y 17XL A:不同天数的流式图；B：凋亡T细胞的绝对数 A: Flow cytometry figures on different days; B: Absolute numbers of CD4+ apoptoticT cells

2.4 大蒜素处理对脾细胞上清IFN-γ和TNF-α水平的影响

从图4看出，在感染后第3天，大蒜素处理组小鼠的IFN-γ和TNF-α水平均显著高于NC组(P<0.05)。在感染后第5天，3 mg/kg组小鼠的TNF-α水平显著高于NC组(P<0.05)，而9 mg/kg组小鼠的IFN-γ和TNF-α水平均显著高于NC组(P<0.05)。

图4 大蒜素处理对脾细胞上清IFN-γ和TNF-α水平的影响Fig.4 The effect of Allicin treatment onthe IFN-γ and TNF-α levels from the supernatants of cultured spleen cellsLA：大蒜素处理对脾细胞上清IFN-γ水平的影响；B：大蒜素处理对脾细胞上清TNF-α水平的影响 A: The effect of Allicin treatment on the IFN-γlevel from the supernatants of cultured spleen cells; B:The effect of Allicin treatment on the TNF-αlevel from the supernatants of cultured spleen cells

3 讨 论

大蒜素作为一种富含硫基的复合物，其发挥抗菌、抗寄生虫的作用主要是通过与微生物内部酶的半胱氨酸残基作用，抑制酶活性[5]。作为一种免疫调节剂，大蒜素能刺激脾细胞增殖[7]以及TNF-α和NO的合成[8]。有研究证实，大蒜素能在体外抑制伯氏疟原虫环子孢子蛋白的发育，并能抑制子孢子蛋白入侵宿主细胞，从而延缓感染早期小鼠的死亡[9]。

疟疾感染之后，宿主的免疫应答时相和应答强度影响感染进程。动物模型和人体研究的结果表明，感染早期强有力的Th1免疫应答对于控制原虫血症至关重要[10-11]，CD4+T细胞及其产生的前炎症细胞因子在控制疟疾感染中发挥重要作用[12]。CD4+T细胞释放IFN-γ来活化效应细胞(如巨噬细胞)，其能通过释放TNF-α和NO来发挥抗疟作用[13-14]。流行病学数据证实疟疾感染可抑制宿主对疟原虫本身的免疫应答。红内期疟原虫利用凋亡机理来清除效应T细胞。Wipasa等[6]用P.yoelii感染小鼠，进一步证实P.yoelii能导致MSP1-19片段特异性Th细胞的凋亡。本研究发现大蒜素能够显著提高小鼠脾脏CD4+CD69+活化T细胞的比例和数量，以及前炎症细胞因子IFN-γ和TNF-α水平，同时抑制CD4+凋亡T细胞的比例和数量，从而提高宿主Th1型前炎症免疫应答，原虫血症水平得到控制，生存期延长。

综上，大蒜素能抑制P.yoelii易感鼠CD4+T细胞凋亡以及感染早期有效的Th1免疫应答的建立，这将为大蒜素的抗疟研究提供重要参考。

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Effects of Allicin on CD4+Activated/Apoptotic T Cells in LethalPlasmodiumyoelii17XL Rodent Malaria Model

FENG Yong-hui1, ZHU Xiao-tong2, SHAN Feng-ping2, CAO Ya-ming2

(1.Dept.ofLab.Med., 1stAffil.Hosp.,ChinaMed.Uni. ,Shenyang110001;2.Tech. &Res.Div.ofImmunol.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122)

The effects of allicin on T cell immune responses in BALB/c mice infected with lethalPlasmodiumyoelii(Py) (Plasmodiumyoelii17XL,P.y17XL) was investigated. Daily oral administration of different doses of allicin (3 mg/kg or 9 mg/kg) on d0-2 afterP.y17XL infection and dynamic monitoring the parasitemia and morality of mice. Spleen cells from BALB/c mice were removed aseptically on d0, d3 and d5 after the infection and activated CD4+T cells (CD4+CD69+) and apoptotic CD4+T cells (7AAD-Annexin V+) were assayed by FACS. IFN-γ and TNF-α in the cultured splenic supernatant were determined by ELISA. The results showed that allicin treatment reduced the parasitemia and prolonged survival time in the infected mice as compared with NC group. Allicin treatment significantly increased the number of activated T cells as well as IFN-γ and TNF-α level in the cultured splenic supernatant, but significantly reduced the number of apoptotic T cells. Therefore, allicin could promote the establishment of effective Th1 immune response during the early infection, thereby inhibit theP.y17XL infection course in the endoerythrocytic stage.

lethalPlasmodiumyoelii17XL; allicin; immune responses; T cells

国家自然科学基金项目(81401285)

冯永辉 男，博士,讲师。主要从事抗感染免疫研究。E-mail：yonghui_feng@hotmail.com

* 通讯作者。男，教授，博士生导师。主要从事抗感染免疫研究。E-mail：ymccmu@163.com

2015-07-23；

2015-11-13

Q939.93;R382.31；R392.12

A

1005-7021(2016)03-0059-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.011