高望界土壤放线菌抗菌活性筛选及生物学特征

程金莲, 刘祝祥, 易 旻, 刘 荷, 李佑稷, 张 丽, 贺建武, 陈义光*

(1.吉首大学 生物资源与环境科学学院,湖南 吉首 416000; 2.吉首大学 化学化工学院, 湖南 吉首 416000)

高望界土壤放线菌抗菌活性筛选及生物学特征

程金莲1, 刘祝祥1, 易 旻1, 刘 荷1, 李佑稷2, 张 丽1, 贺建武1, 陈义光1*

(1.吉首大学 生物资源与环境科学学院,湖南 吉首 416000; 2.吉首大学 化学化工学院, 湖南 吉首 416000)

为了从土壤环境中筛选产生抗菌活性物质的放线菌，采用琼脂扩散法对分离自湖南省高望界自然保护区森林土壤的169株放线菌进行抗菌活性检测，采用16S RNA基因序列分析法进行系统发育分析，采用常规方法进行生物学特性研究。结果表明，有47株受试菌株的发酵产物显示抗菌活性阳性(27.8%)，其中6株具有较强抗菌活性。形态观察结果表明，这6株菌株均为典型的产丝产孢放线菌，在多数培养基上生长良好，气生菌丝和孢子丝丰富。系统发育分析表明，6株菌株均属于链霉菌属(Streptomyces)，归为5个物种。菌株JSM 147612、JSM 147786、JSM 147831和JSM 147846分别与链霉菌属的已知物种S.violascens(序列相似性为99.93%)、S.malachitospinus(99.65%)、S.anulatus(99.72%)和S.aureus(99.38%)系统发育关系最为密切；菌株JSM 147823和JSM 147842之间的序列相似性为99.86%，应该属于同一物种，与它们系统发育关系最为密切的是S.albidoflavus(相似性分别为99.72%和99.58%)。

放线菌; 抗菌活性; 生物学特性; 系统发育

放线菌是一类具有高G+C含量的革兰阳性菌，常见的放线菌能产生典型的丝状体，以孢子丝产生无性孢子为主要的繁殖方式[1]。放线菌主要分布于土壤环境，类群多样，形态丰富，不仅在生态系统中占有极其重要的地位，而且生理类型多样，能产生丰富的生理活性物质[2-3]。目前发现的天然生物活性物质中有40%分离自放线菌，其中临床和农业生产中使用的150多种抗生素中有2/3分离自放线菌[4-5]。高望界国家级自然保护区(28°36′～28°46′N, 110°14′～119°48′E)面积20 002 hm2，位于武陵山脉南坡中段，行政区划归湖南省湘西土家族苗族自治州吉首市。海拔起伏较大，最高处为高望界，海拔1 146.2 m；最低处为罗依溪镇，海拔190 m[6]。高望界保护区地貌独特，地势崎岖陡峭，沟壑纵横，溪河密布，生物多样性丰富，是多样性山地混合森林生态系统保存比较完整的区域，境内有较大面积的原始次生常绿阔叶林[1]。因此，在生态系统保存比较完整以及生物多样性丰富的高望界自然保护区进行放线菌的分离、寻找更多的物种资源，具有潜在的价值。本文报道了对分离自高望界森林土样中的放线菌进行抗菌活性筛选、生物学特性和系统发育分析研究结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 49份森林土壤样品于2014年8月采自高望界国家级自然保护区中高海拔区域，范围为28°39′02.3"～28°42′36.8"N和110°03′24.4"～110°10′34.3"E, 海拔高度633～1 017 m。主要采集原始次生常绿阔叶林和混交林林下地表层以下10 cm左右的土样，于48 h内带回实验室进行放线菌分离，菌株纯化后，综合分析菌落特征、显微形态和可溶性色素等特征，初步排除冗余，得到169株放线菌用于多样性分析和抗菌筛选。

1.1.2 菌株 用于抗菌活性筛选的敏感指示菌共8株，均保存于本实验室。革兰阴性菌3株，即Enterobacteraerogenes(产气杆菌) ATCC 8724、Escherichiacoli(大肠埃希菌) ATCC 128和Proteusvulgaris(变形杆菌) ATCC 8427；革兰阳性菌3株，即Bacillussubtilis(枯草芽胞杆菌) ATCC 6051、Sarcinalutea(藤黄八叠球菌) GC-MCC 1.880和Staphylococcusaureus(金黄色葡萄球菌) ATCC 25922；真菌2株，即Candidaalbicans(白色念珠球菌) NCPC 1027和Asperillusniger(黑曲霉) NCPC 1003。

1.1.3 培养基 ①察氏琼脂、马铃薯浸汁琼脂和国际链霉菌计划(InternationalStreptomycesProject, ISP)系列培养基按文献[9]配制；②ISP系列培养基(4种)：酵母膏麦芽膏琼脂(以下简称ISP 2)、燕麦片琼脂(ISP 3)、无机盐淀粉琼脂(ISP 4)和甘油天冬酰胺琼脂(ISP 5)；③发酵液体培养基：葡萄糖4 g ，酵母膏4 g，麦芽膏10 g，微量盐溶液1 mL(配方为FeSO4·7H2O 0.1 g，MnCL2·4H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g， K2HPO40.05 g，去离子水1 000 mL)，去离子水1 000 mL，pH 7.2。

1.1.4 仪器与试剂 恒温振荡器(IS-RDD3)购自美国精骥有限公司，光学显微镜(Motic TYPE102M)购自麦克奥迪实业集团有限公司，Hitachi(日立)S-3400N型扫描电镜购自日立公司；PCR引物由上海生工合成；其他仪器和试剂同文献[8]。

1.2 方法

1.2.1 抗菌活性检测 放线菌菌株用ISP 2平板活化后，接种到ISP 2斜面培养5～7 d，待孢子成熟。发酵液体培养基用500 mL三角瓶分装150 mL，灭菌冷却备用。小心刮下斜面孢子接种，28 ℃、200 r/min震荡培养96 h。收集发酵液，4 000 r/min离心10 min，取上清液用琼脂扩散法[10]检测其抗菌活性。每个牛津杯加样20 μL，30 ℃培养48 h后测定抑菌圈直径。在初步筛选结果的基础上，用同样方法对初筛阳性菌株进行二次复筛，每个菌株做3次重复。

1.2.2 形态观察 采用ISP 2、ISP 3于28 ℃下进行埋片培养，分别于14和28 d取出埋片，光学显微镜和扫描电镜观察菌株显微形态。

1.2.3 培养特征和生理生化特性 用ISP系列培养基(ISP 2、ISP 3、ISP 4和ISP 5)、察氏琼脂和马铃薯浸汁琼脂进行培养，按Shirling[9]方法观察并记录培养特征，用ISCC COLOR CHARTS色谱[11]记录颜色。按照文献[12]的方法进行生理生化实验。

1.2.4 16S rRNA基因序列测定和系统发育分析 按文献[13]使用的方法进行菌株基因组DNA的提取及16S rRNA基因扩增，由上海生工完成测序。用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EzTaxon-e(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)提供的数据库和Blast软件进行相似性计算和最相似序列搜索，用CLUSTAL X软件进行多序列比对[14]，用MEGA 4.0软件包中的邻接法(Neighbor-Joining method)进行聚类分析和进化树构建[15]。重复取样1 000次进行自展值(bootstrap value)分析，用以对进化树的稳定性进行评价[16]。

2 结果与分析

2.1 抗菌活性筛选

结果表明，169株放线菌菌株中，共有47株菌的发酵液至少对1株指示菌有抗菌活性，阳性率为27.8%；有6株菌株(JSM147612、JSM147786、JSM147823、JSM147831、JSM147842、JSM147846)的发酵产物抗菌活性较强(表1)。其中JSM147842和JSM147846对4种指示菌有抗菌活性；除JSM147823外，其他5株均能抑制革兰阳性菌株藤黄八叠球菌。

注：“-”表示无抗菌活性

2.2 形态特征和培养特征

对6株抗菌效果较好的菌株进行培养特征及显微形态的观察。结果表明，这些菌株为典型的产丝产孢放线菌，在多数培养基上生长良好(表2、图1)。除菌株JSM 147612、JSM 147823和JSM 147842在察氏琼脂、ISP 2和ISP 4培养基上生供试培养基上均生长良好，可产生丰富的气生菌丝和基内菌丝；除长一般外，其他菌株在6种JSM147831外，其他菌株在马铃薯浸汁琼脂培养基上均产生可溶性色素，且JSM 147846能在4种培养基上产生可溶性色素(表2)。菌株JSM 147823孢子丝多分枝，菌株JSM 147786和JSM 147831的孢子为丝波曲状，其他菌株的孢子丝为长链状。所有菌株均产生圆柱型或椭球形、光滑不游动的分生孢子(图 1)。

图1 抗菌活性较强的6株菌在酵母膏-麦芽膏琼脂培养基上17 d的菌丝体扫描电镜照片Fig.1 Scanning electron micrographs of the 6 antimicrobial-activity-positive strains on yeast-malt extract agar for 17 days A:JSM 147612; B:JSM 147786; C:JSM 147823; D:JSM 147831; E:JSM 147842; F:JSM 147846

表2 抗菌活性较强的6株菌的培养特征Table 2 Cultural characteristics of 6 antimicrobial-activity-positive isolates

注：“-”表示不产生可溶性色素

2.3 生理生化特性

对6株抗菌效果较好的菌株进行部分生理生化特性的观察，结果表明所有菌株耐受的温度范围为12～40 ℃，耐受pH范围为5～11，均能分解Tween-60和尿素。这些菌株的其他部分生理生化特征结果见表3。

表3 抗菌活性较强的6株菌的生理生化特征Table 3 Phenotypic characteristics of 6 antimicrobial-activity-positive isolates

注：“+”表示阳性;“-”表示阴性;“w”表示弱阳性

2.4 系统发育分析

目前普遍认为，如果原核微生物菌株间的16S rRNA基因序列相似性大于97%，这些菌株应该归属于同一物种[13]。采用16S rRNA基因序列分析法对6株抗菌活性较强的菌株进行了系统发育分析，结果表明这些菌株均属于链霉菌属(Streptomyces)，可归为5个物种。其中菌株JSM147612、JSM147786、JSM147831和JSM147846分别与链霉菌属的4个已知物种S.violascens(序列相似性为99.93%)、S.malachitospinus(99.65%)、S.anulatus(99.72%)和S.aureus(99.38%)的系统发育关系最为密切；菌株JSM147823和JSM147842之间的序列相似性为99.86%，在系统进化树上聚在一起，应该属于同一物种(图2)。与菌株JSM147823和JSM147842系统发育关系最为密切的已知物种是S.albidoflavus，16S rRNA基因序列相似性分别为99.72%和99.58%。

图2 采用邻接法构建的抗菌活性较强的6株菌的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree constructed by the Neighbor-Joining method on the basis of 16S rRNA gene sequences. Bar, 0.5 substitutions per 100 nucleotides

3 讨 论

土壤是放线菌生存的重要场所，有着极其丰富的放线菌资源，放线菌产生的生物活性物质中最突出的特性是能够产生抗生素。放线菌产生的抗生素被广泛用于人类医疗保健、农作物病虫害和畜禽疾病控制以及淀粉酶等有用代谢产物生产等方面[17-18]。但是，人类仍然面临着一些新的难以治愈和控制的疾病，所以迫切地想要从丰富的微生物资源宝库中寻找新药物。目前，土壤中的大部分放线菌还未被分离，因此，从土壤环境中分离新的具生物活性的放线菌菌株对开发新药具有重大意义。姜成林等[19]对不同土壤放线菌研究发现，原始森林放线菌种类最多，以次生林、旱地和蔬菜地的顺序，放线菌的种群呈逐渐单调化。高望界自然保护区受人类影响较小，生物多样性复杂，很有可能分离到更多种类或者新的放线菌菌株，对寻找新的生物活性物质有一定的潜在价值。

本研究结果表明，湖南省高望界自然保护区森林土壤中分离的169株菌中有47株菌的发酵液具有对1种以上敏感指示菌有抗菌活性，抗菌阳性率为27.8%。其中有6株抗菌活性较强。系统发育结果表明，这6株菌均属于链霉菌，与国内外报道一致[20-22]。从高望界森林土样中分离得到的放线菌是一类抗生素来源微生物资源，具有潜在的应用开发价值。

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Screening and Biological Characteristics of Antibiotic-Producing Actinomycetes from Soil in Gaowangjie National Natural Reserve in Hunan Province

CHENG Jin-lian1, LIU Zhu-xiang1, YI Min1, LIU He1, LI You-ji2,ZHANG Li1, HE Jian-wu1, CHEN Yi-guang1

(1.Coll.ofBiol. &Environ'lSci., 2.Coll.ofChem.andChem.Engin.,JishouUni.,Jishou416000)

In order to screen antibiotic-producing actinomycetes from soil environment, 169 strains of actinomycetes were isolated from forest soil samples collected from the Gaowangjie National Natural Reserve, Jishou, Hunan Province, and screened using agar-diffusion method with 8 sensitive strains as sensitive indicators (three G-positive bacteria, three G-negative bacteria, two fungi) to determine and test for their antibiotic activities; And used 16S RNA gene sequence analysis to carry out phylogenetic analysis, studied their biological characteristics with routine methods. The results indicated that there were 47 tested strains showed their fermented products were antibiotic activities positive (27.8%), and among them 6 strains belonged to the genus ofStreptomycesand classified into 5 species. Strains JSM 147612, JSM 147786, JSM 147831, JSM 147842, JSM 147846 were the closest to the known species in phylogenetic relation with the genus ofStreptomycesrespectively,S.violascens(the sequence similarity of 16S RNA at 99.93%),S.malachitospinus(99.65%),S.anulatus(99.72%),S.aureus(99.38%); and sequence similarity of strain JSM 147823 and JSM 147842 was 99.86%, both should belong to the species, the closest species in phylogenetic relation wasS.albidoflaus(the similarity was respectively at 99.72% and 99.58%).

actinomycetes; antimicrobial activity; biological characteristics; phylogenetic analysis

国家自然科学基金项目(31460004)；湖南省重点学科项目(JSU071312Z01)；湖南省高校科技创新团队项目(201208Z01)；吉首大学项目(JSKY201402)

程金莲 女，硕士研究生。研究方向为微生物资源与生态。E-mail: 463505803@qq.com

* 通讯作者。男，教授，博士，硕士生导师。研究方向为微生物资源与分类学。Tel: 0743-8564416, E-mail: mchenjsu@aliyun.com

2015-06-08；

2015-08-27

Q93

A

1005-7021(2016)03-0014-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.003