环果寡糖果糖基转移酶研究进展

石方卉， 侯英敏， 唐文竹

(大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034)

环果寡糖果糖基转移酶研究进展

石方卉， 侯英敏， 唐文竹*

(大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034)

环果寡糖果糖基转移酶(CFT酶)是一种多功能型酶，能催化三种转糖基反应(环化、歧化和耦合)以及水解反应，而其中能将菊糖水解为环果寡糖的环化反应是其特征性反应。环果寡糖的独特结构使其在医药、化工等领域具有潜在应用价值。简要论述了环果寡糖的结构和应用，重点论述了环果寡糖果糖基转移酶的酶学性质、基因克隆和表达，以及功能和催化机理等方面的最新研究进展。

环果寡糖果糖基转移酶；环果寡糖；菊糖

菊糖(inulin)，也被称作菊粉，是一种由D-果糖单体通过β-2,1-糖苷键连接而成的链状多糖，且分子链的末端含有一个葡萄糖残基。自然界中许多植物中都含有大量的菊糖，例如菊苣、大丽花和洋姜等，其在植物中主要起到储存碳水化合物的作用[1]。菊糖降解酶是一类能够催化水解菊糖中β-2,1-呋喃果糖苷键的酶，根据其对底物作用形式以及产物的不同，可以将菊糖降解酶分为三类。第一类是外切型菊糖酶(exoinulinase)(EC 3. 2. 1. 80)，主要作用于菊糖分子链非还原性末端的糖苷键，能从菊糖链的末端逐一水解释放出果糖，主要产物为果糖以及少量的葡萄糖，已发现的大多数菊糖酶都属于此类。另一类是内切型菊糖酶(endoinulinase)(EC 3. 2. 1. 7)，可在菊糖分子内部随机切断任意β-2,1-糖苷键，产物为不同聚合度的低聚果糖[2]。工业生产中可以分别使用这两类酶来转化菊糖获得高果糖浆或者低聚果糖，所以国内外对于它们的酶学性质和应用等都进行了较为详尽的研究[3-7]。第三类为环果寡糖果糖基转移酶(cycloinulooligosaccharide fructanotransferase)，简称为CFT酶，该酶通过催化分子内的转果糖基反应，形成由6～8个D-呋喃果糖单元以β-2,1键连接而成的环果寡糖。目前关于CFT酶的研究相对较少，已有的研究成果主要集中在日本和韩国，国内未见报道。

1 环果寡糖的结构和应用

晶体结构分析显示环果寡糖有一个冠醚核心，并且在大环中果糖单元是在冠醚核心的上下交错排列的，如图1所示。晶体结构显示，在环己寡糖中1-O、3-O 和4-O 原子位于分子的一面，而1-CH2和6-CH2基团位于相对的另一面，结果导致分子的一面是亲水的，而另一面是疏水的[8]。由于分子中心存在特有的冠醚，使得环果寡糖能够通过偶极电荷间的静电作用结合阳离子。HMR 分析表明环果寡糖可以在D2O 中络合许多金属离子[9]。而甲基化的环果寡糖可以在甲醇溶液中结合金属阳离子，从而能够促进金属离子参与的有机合成过程[10]。在毛细管电泳中，无毒且溶解性好的环果寡糖及其甲基化衍生物可以替代冠醚用于水相或者有机相中金属离子的螯合[11]。而硫酸化的环果寡糖可以作为部分氨基酸衍生物对映体的手性选择剂[12]，且其对某些药品的分离效果要优于硫酸化的环糊精[13]。同时，甲基化或者戊基化的环果寡糖衍生物也可作为气相色谱中新型的手性选择剂用于部分脂类、β-内酰胺、醇类以及氨基酸衍生物等对映体的分离[8]。近期研究发现，异丙基氨基甲酸酯基环己寡糖、R-萘基乙基氨基甲酸酯基环己寡糖和二甲苯基氨基甲酸酯基环庚寡糖作为液相色谱中的键合手性固定相可以选择性分离包括氨基萘酚、胺类、手性酸、金属复合物、钌(II)多吡啶配合物在内的多种外消旋化合物[14-16]。

图1 环果寡糖的结构[8]Fig.1 Structure of cyclofructans[8]

2 环果寡糖果糖基转移酶的酶学性质

自1989年第1株产生胞外CFT酶的菌BacilluscirculansOKUMZ 31B 从土壤中分离出来后[17]，目前已经获得的能够产生该酶的菌株如下：BacilluscirculansMCI-2554[18]、Bacillussp. CFC1[19]、BacilluspolymyxaMGL21[20]、Paenibacilluspolymyxa[21]、Paeniballusmacerans[22]、PaenibacilluspolymyxaMG-CF6[23]，均为芽胞杆菌属或者类芽胞杆菌属的细菌。由于所有菌株都产生胞外酶，一般都采用常规处理方法进行分离纯化，如离心和/或超滤、无机盐或有机溶剂沉淀、各种柱层析、电泳等。但是不同来源的CFT酶其酶学性质有所差别。最早Kawamura 等[24]从BacilluscirculansOKUMZ 31B 胞外粗酶液中分离得到2个CFT酶组分FI 和FII，分子量分别为132、126 kDa，而等电点均为pI 4.1，且均在pH 7.5、40 ℃ 时酶活最高，因此推测FII 为FI 经过特定蛋白酶水解后形成的，该酶水解菊糖产物中环己果糖与环庚果糖的比例为4∶1，同时还有少量的环辛果糖。而来源于BacilluscirculansMCI-2554 的CFT酶分子量为115 kDa，与前面提到的FI 相比，性质比较接近，只是温度稳定性更高一些。另外，通过对一小段肽段的氨基酸序列分析比对后发现其与β-呋喃果糖苷酶同源性最高[18]。菌株BacillusmaceransCFC1 胞外CFT酶分子量为110 kDa，最适作用pH 和温度分别为pH 7.5和45 ℃，且在pH 6.0～9.5及45 ℃ 以下都很稳定。底物特异性研究发现，其可以作用于分子量大于蔗果四糖以上的寡糖[25]。后来，Nanjo 等[23]从土壤中分离到1株CFT酶生产菌PaenibacilluspolymyxaMG-CF6，经纯化后该酶大小为128 kDa，最适作用条件与前面提到的酶差别均不大，转化菊糖的产物中环己果糖与环庚果糖的比例为2.5∶1。

3 环果寡糖果糖基转移酶基因的克隆和表达

目前关于CFT酶的分子生物学研究，主要局限于酶基因的克隆和异源表达。最早报道于1997年，Kanal 等将来源于BacilluscirculansMCI-2554 的CFT酶基因去掉前端重复序列后，在异柠檬酸裂解酶5′上游序列的调控下，实现了在酿酒酵母中的分泌表达。纯化后的重组CFT酶包括3种组分，CFTase1、CFTase2 和CFTase3，其分子量分别为116、117、116 kDa，经过分析后推测CFTase1 是CFTase2 在N 端被蛋白酶酶解后的产物，而CFTase2 为CFTase3 糖基化后形成的。其中CFTase2 的酶学性质与从野生菌中获得的酶类似，但是热稳定性明显提高。同时，增加酿酒酵母中酶基因拷贝数后，酶活力大大提高[26]。Kim 等从BacillusmaceransCFC1 中也获得了CFT酶基因，并在大肠埃希菌中实现表达，重组酶大小为150 kDa，与理论预测值一致，却明显大于从野生菌中获得的110 kDa 的酶，于是对该基因前面一段截短后重新进行异源表达，获得了与野生型接近的107 kDa 的重组酶。进一步通过免疫印迹和酶谱分析推测野生菌中最初也能形成150 kDa 的酶，但是在过膜运输过程中其被蛋白酶水解后成为107 kDa。因此，研究者认为完整的CFT酶包括3个区域：N 端信号肽、N 端可切割区域及核心催化结构域[27]。Jeon 等通过对来源于BacilluspolymyxaMGL21 的CFT酶基因的ORF 进行分析，发现其可以分为5 个不同的区域，即N 端有2个重复序列R1 和R3，C 端有1个重复序列R4，中间包括1个内切菊糖酶的同源区段HER 和1个高度保守的核心区段CR,且CR 中包含6 个高度保守区[20]。随着酵母表面展示技术的发展，来源于Paenibacillusmacerans的CFT酶基因与Aga 2p 融合表达后，再与膜锚定蛋白Aga 1p 相连，从而在酿酒酵母细胞表面表达[22]。后来的1个克隆自PaenibacilluspolymyxaMG-CF6 的CFT酶基因包含3 999 个核苷酸，与来源于BacilluscirculansMCI-2554、BacillusmaceransCFC1(后改名为PaenibacillusmaceransCFC1)及BacilluspolymyxaMGL21(后改名为PaenibacilluspolymyxaMGL21)的CFT酶氨基酸序列的同源性分别为83%、95%和98%[23]。我们将从NCBI 中获得的7 个CFT酶的基因序列使用DNASTAR 软件包中的Megalign 程序进行同源性分析，结果发现来源于类芽胞杆菌属的CFT酶基因之间的同源性较高，其中除了来源于PaenibacillusmaceransCFC1 的CFT酶基因以外，其余5 个基因之间的同源性都在97% 以上，而唯一一个芽胞杆菌属的CFT酶基因与其余类芽胞杆菌属的CFT酶基因之间同源性则较低，在63%～79%之间。由此可见，CFT酶具有一定的种属特异性。

一般认为，CFT酶为诱导酶，只有在以菊糖为碳源的培养基中，细菌才会产酶，而葡萄糖存在明显的分解代谢物阻遏效应。Kim 等[28]发现，不仅在野生菌BacillusmaceransCFC1 中酶的合成存在菊糖诱导和葡萄糖阻遏效应，将该酶基因导入枯草芽胞杆菌后，同样存在这两种代谢调节现象，且代谢物效应元件不在CFTase 基因启动子的上游，而是定位于启动子下游，同时与代谢物阻遏蛋白CcpA 无关。

4 环果寡糖果糖基转移酶的催化功能

通过对CFT酶催化功能的研究发现，CFT酶底物特异性较低，属于多功能酶。其中来源于BacillusmaceransCFC1 的CFT酶可以将果糖基蔗果四糖(GF4)转化为环己果糖(CF6)和蔗糖，证明该酶可以催化歧化反应，而分别以蔗糖和CF6 为果糖基受体和供体反应时，产物为GF2、GF3 和GF4，推测该酶首先催化蔗糖与CF6 耦合形成GF7，然后GF7 和蔗糖间或者不同GF7间发生歧化反应形成多种寡糖产物[25]。Kawamura等研究发现CFT酶可以催化CF6 与甲基化吡喃葡萄糖苷反应生成多种寡糖。反应过程首先是CF6 的开环，然后是与甲基化吡喃葡萄糖苷耦合，或者是水解形成寡糖，同时各种产物又可以作为酶的底物参与反应，从而形成多种聚合度的寡糖[29]。该研究小组接着又研究了21 种糖与CF6 在CFT酶催化下的反应过程，结果发现甘露糖、山梨糖、甲基吡喃葡萄糖苷和甲基吡喃甘露糖苷可以作为有效受体提高酶催化CF6 水解的活性，推测可能是因为与这些不规则底物的相互作用导致了酶结构的改变，从而使得水分子更容易进入催化位点[30]。将异源表达的来源于BacilluspolymyxaMGL21 的CFT酶纯化后，分别与菊糖、GF4 和CF6 反应，结果显示，当以菊糖为底物时，该酶主要催化环化反应，产物以CF6 为主；而以GF4 为底物时，最初的产物为GF7，说明发生了歧化反应，后来产物更加复杂，包括CF6、F3、GF 等；以CF6 为底物时，CF6 被水解形成了F3 和F4 等[20]。较近的研究发现，CFT酶催化蔗糖与CF6 反应时，作为果糖基供体的CF6 浓度超过一定值后，寡糖产物平均聚合度会增加，而作为果糖基受体的蔗糖浓度增加则能抑制水解反应的发生[31]。因此我们认为， CFT酶与属于α -淀粉酶家族的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase)(EC 2.4.1.19)即CGT酶的功能非常接近，能催化环化、歧化和耦合3种转糖基反应以及水解反应，见图2[32]。

图2 CFT酶催化反应类型Fig.2 Schematic presentation of CFTase catalyzed reaction 黑色圆点代表果糖基;A:：环化；B：歧化；C：耦合；D：水解 The circles represent fructose residues;A：cyclization; B：disproportionation; C：coupling; D：hydrolysis

5 环果寡糖果糖基转移酶的催化机理研究

迄今为止，关于CFT酶催化机理的研究相对较少，且尚未形成统一的理论。Lee 等发现来源于BacillusmaceransCFC1 的CFT酶的N 端氨基酸残基241～389 之间存在一个菊糖结合结构域(IBD)，去掉之后仅保留催化活性而会失去结合不溶性菊糖的能力。IBD 中包含34 个芳香族氨基酸，如果将这些氨基酸进行化学修饰后，底物结合能力减少26%。同时，在Mg2+存在时，IBD 的活性增加一倍，可能是因为二价阳离子能中和蛋白表面特别是在活性位点附近负电荷间的排斥作用，因此推测IBD 与菊糖之间的结合主要靠电荷相互作用[33]。You 等[34]对异源表达的CFT酶基因进行不同截断处理后推测了不同结构域的功能，结果发现其N 端重复序列R1 和R3 没有明确功能，C 端重复序列R4 主要负责底物环化活性以及环果寡糖水解活性，而内切菊糖酶的同源区段HER 和核心区段CR,共同完成菊糖水解以及歧化反应。

6 展 望

从20世纪80年代开始，国外陆续出现关于CFT酶的研究报道，而国内到目前为止未见关于此酶的报道。虽然对于酶的性质、功能等方面有了一定的认识，但是对CFT酶的底物结合方式，转糖苷反应机理以及环化机理等的了解仍很缺乏。我们通过比对发现已有的CFT酶的氨基酸序列与已知的糖苷水解酶同源性很低，很难使用同源建模对CFT酶进行分析，同时也缺少CFT酶晶体结构的X 射线衍射数据，所以关于CFT酶的三维结构和机理仍有待于进一步研究。同时，由于CFT酶多功能酶的特点，其转化菊糖产物中除了不同比例的6～8 个果糖单元组成的环果寡糖外，还有不同聚合度的多种果寡糖混合物，且目前糖分离技术还不十分成熟，所用方法大都是以分子量截留为基础的色谱或膜分离技术，分辨率较低且成本过高，很难获得高纯度的聚合度单一的环果寡糖，这也在很大程度上限制了CFT酶的应用。

要打破这些生产限制，扩大环果寡糖的生产规模，可以从以下几个方面开展研究:①首先要继续筛选CFT酶高产菌株，并通过诱变等手段选育转化菊糖产物专一性高、催化能力强的菌株;②尝试各种固定化方法，并通过反应进程的控制，提高酶的利用率和环果寡糖的得率;③进一步开展CFT酶催化功能的研究，包括酶作用的底物范围，以及酶催化不同底物时各种产物形成过程的分析；④深入开展CFT酶催化机理的研究，获得重组CFT酶结晶并进行X 射线衍射分析，确定酶的结构域组成及每个结构域中包含的二级结构，分析其中特征性的结构，并通过公用数据库与其他糖苷水解酶晶体结构进行比较，找到保守的氨基酸残基，推测底物结合位点及关键活性位点氨基酸的功能，确定CFT酶催化转糖苷反应特别是环化反应的机理。总之，随着研究的深入，关于CFT酶结构和功能的研究必将会有新的突破，环果寡糖工业也将进入新的发展阶段。

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Advances in Cycloinulooligosaccharide Fructanotransferase

SHI Fang-hui, HOU Ying-min, TANG Wen-zhu

(Schl.ofBio-Engin.,DalianPolytech.Uni.,Dalian116034)

Cycloinulooligosaccharide fructanotransferase (CFTase) is a multifunctional enzyme, which can catalyze three transglycosylation reactions (cyclization, disproportionation and coupling), and a hydrolysis reaction. Cyclization is the characteristic reaction of CFTase, which can transform inulin into cyclofructans. Because of the unique construction of cyclofructans, they have potential application value in the medical and chemical industry. In this paper, the structure and applications of cyclofructans, and particularly advances in the enzymological feature, the genetic cloning, and expression, as well as the function and catalyzation mechanism etc. of CFTase were focused in this paper.

cycloinulooligosaccharide fructanotransferase (CFTase); cyclofructans; inulin

国家自然科学基金项目(31101227)；辽宁省自然科学基金项目(2014026013)

石方卉 女，硕士研究生。研究方向为生物工程。Tel：0411-86318692，E-mail：fanghui1881@sina.com

* 通讯作者。女，博士，副教授，硕士生导师。研究方向为微生物与生物催化。Tel：0411-86318692，E-mail：tangwz@dlpu.edu.cn

2015-06-04；

2015-07-02

Q939.9

A

1005-7021(2016)03-0086-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.016