南京莫愁湖与紫霞湖浮游细菌群落结构的季节性变化及其与环境因子的关系

曹新益，徐慧敏，王司辰，黄 睿，沈 烽，何肖微，余钟波，赵大勇

(1.河海大学 水文水资源与水利工程科学国家重点实验室，江苏 南京 210098；2.河海大学水文水资源学院，江苏 南京 210098)

南京莫愁湖与紫霞湖浮游细菌群落结构的季节性变化及其与环境因子的关系

曹新益1，2，徐慧敏1，2，王司辰1，2，黄 睿1，2，沈 烽1，2，何肖微1，2，余钟波1，2，赵大勇1，2

(1.河海大学 水文水资源与水利工程科学国家重点实验室，江苏 南京 210098；2.河海大学水文水资源学院，江苏 南京 210098)

应用16S rRNA基因末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术和多元统计方法研究了南京莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构的季节性变化及其与环境因子的关系。结果表明，莫愁湖和紫霞湖的浮游细菌群落alpha多样性指数在夏季和秋季时最高，在春季和冬季时最低；紫霞湖冬季浮游细菌群落alpha多样性指数显著大于莫愁湖。非度量多维尺度(NMDS)分析结果显示，莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构存在明显的季节性变化。Mantel检验、典范对应分析(CCA)表明，影响莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构最显著的环境因子是温度和pH值，营养物对莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构的影响程度取决于湖泊的营养水平。为进一步研究不同程度富营养化水体中的浮游细菌群落结构差异提供了帮助。

莫愁湖；紫霞湖；浮游细菌；群落结构；季节性变化；环境因子；多元统计；末端限制性片段长度多态性技术

莫愁湖是南京市一个重要的景观类湖泊，近年随着经济的发展，其生态环境遭到破坏，水质属劣Ⅴ类水平[1]，已经呈现较为严重的富营养化状态。莫愁湖富营养化的主要限制因子为氮[2]，近年来采取底泥疏浚、截污等措施，水质有了明显改善。紫霞湖是位于南京市中山陵风景区的人工蓄水湖泊，外源营养物质补给较少，为典型的低纬度贫营养型湖泊[2-3]。目前，对莫愁湖的富营养化、真核浮游生物、浮游植物、重金属污染[2，4-6]和紫霞湖的浮游动物、浮游植物、重金属污染[2，4，7]方面的研究报道较多，但对两湖浮游细菌群落结构的研究较少。

浮游生物作为水体生态系统中的优势种，是高等水生动植物赖以生存的重要物质与能量基础，在生态系统中起着至关重要的作用[8]。浮游细菌是指浮游生物中的原核生物类群，主要包含古细菌、自养细菌和异养细菌[3]。浮游细菌对水体生态系统中食物链基本环节的发展有着决定性作用，浮游细菌在水体生态系统中的作用以及影响浮游细菌的环境因素受到研究者的广泛关注[9]。区域特点和湖泊水体的营养水平均可以影响湖泊浮游细菌多样性和群落结构的组成，导致水体浮游细菌群落结构的组成发生变化[10]。浮游细菌数量多，在污染物降解和氮磷等营养物循环过程中发挥着重要作用[11]。浮游细菌受外部环境的影响非常显著[12]，因此，浮游细菌群落结构组成的改变可以在一定程度上反映该水体环境状态，研究表明浮游细菌在水质调控中起着重要作用[13-14]，目前对于浮游细菌群落在富营养化水体中的分布研究取得了很大进展[15-16]。

研究表明，水体生态系统中的营养盐既可通过“上行效应”直接对细菌群落的组成和分布造成影响[17-19]，也可通过对水体细菌捕食者的组成和丰度的扰动间接影响水体细菌群落结构和多样性[20]。目前，越来越多的研究者开始关注浮游细菌与环境因子之间的关系[21-22]，由于浮游细菌与环境因子的关系较为复杂，目前大部分研究仍在摸索阶段[23]。Haukka等[24]和Wu等[25]研究发现，在向淡水生态系统中添加营养物质后，浮游细菌的群落结构发生了变化，这种变化可能与水体营养水平的升高有关，这表明淡水湖泊的营养状态可能是影响浮游细菌群落结构的重要因素。

作为降解者的微生物群落，浮游细菌个体结构简单，对环境变化敏感，其群落结构组成和多样性能够在一定程度上反映水体环境质量状况[8]，因此，调查年内莫愁湖和紫霞湖中浮游细菌群落结构组成的变化有助于更好地理解其生态系统。边园琦等[3]对紫霞湖的浮游细菌群落结构进行了研究，但并未研究紫霞湖浮游细菌群落结构的季节性变化；沈烽等[26]应用高通量测序技术对莫愁湖和紫霞湖的浮游细菌多样性进行了研究，但并未探究浮游细菌群落结构与环境因子之间的关系；Bai等[16]研究了高原湖泊滇池沉积物细菌多样性，发现沉积物细菌多样性的分布存在时空差异，并且受季节变化的影响；Ma等[27]研究粤东海水增养殖区浮游细菌数量变化时发现，季节是影响浮游细菌数量的重要因素。季节变化会导致湖泊水体温度、pH值等环境因子的变化，同时改变浮游植物光合作用强度，导致水体中有机物含量变化[28]。因此，研究湖泊浮游细菌群落结构的季节性变化、探究导致这种变化的影响因子是必要的。

末端限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)技术是一种新兴的分子生物学技术[29-30]，该技术不必进行细菌培养即可进行细菌群落分析[31]，可以有效地应用于微生物群落的对比分析和微生物多样性分析[32]。自1997年Liu等[33]应用T-RFLP技术研究微生物的多样性以来，T-RFLP技术已被广泛应用于土壤[34-36]、植物根系[37]、污水处理[38]、湖泊沉积物[39]、淡水水体[40]等方面的研究。

作者应用T-RFLP技术对南京莫愁湖和紫霞湖一年内四个季节的浮游细菌群落结构进行分析，研究2个湖泊浮游细菌群落结构的季节差异，通过多元统计方法研究浮游细菌群落结构与环境因子的关系，探讨影响莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构的关键环境因子，拟为莫愁湖和紫霞湖污染水体的生态修复提供理论依据，丰富对城市湖泊水体浮游细菌多样性、浮游细菌群落结构与环境因子相互关系的认识。

1 实验

1.1 水样采集

在2011年1月至2012年1月间，每个季节对莫愁湖和紫霞湖各采集一次水样，每次采集3～4个平行样本，采样点均匀分布在湖区内。

使用采水器采集距水面0.5 m处的水样1 000 mL，分装在灭菌蓝盖玻璃瓶中(期间现场测定水样的温度及pH值)，密封，避光保存在4 ℃保温箱中，尽快运回实验室进行后续处理。

1.2 理化指标分析

1.3 T-RFLP分析

取上述经过0.22 μm滤膜过滤的水样，参照文献[39]进行DNA提取。PCR扩增反应采用细菌通用引物对27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和926r(5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′)。PCR反应体系和循环条件参照文献[41]。扩增体系为50 μL，包含 5×PCR buffer 10 μL、0.25 mmol·L-1dNTP、2.5 mmol·L-1镁离子、0.2 mmol·L-1上下游引物、10 ng DNA模板、2 U Taq酶，加去离子水至50 μL。扩增程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸7 min。4 ℃保存，进行下游分析。

PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳检测后使用核酸片段分析仪(CEQ8000型，Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)对酶切产物进行T-RFLP分析，分析时控制碱基长度介于60～600 bp、相对丰度超过1%的片段的末端限制性片段，即T-RFs。按T-RFs占各个样品的丰度百分比进行标准化，再分别计算每个样品浮游细菌群落的alpha多样性指数(Simpson指数和Shannon指数)，以研究水体中浮游细菌群落的多样性和均一度。

对每组样品的多样性指数做anova检验，用a、b、c、d分别标注多样性指数有显著差异的样品(P<0.05)。

1.4 alpha多样性指数分析

采用Shannon(H′)和Simpson指数(D)进行浮游细菌群落的多样性评价[39]。

(1)

(2)

式中：S为物种总数；Pi为第i个峰面积占总面积的比例，即T-RFs的相对丰度。

1.5 多元统计分析

利用R语言软件(R programming language,version 3.2.3)中的Vegan软件包完成如下分析：非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析、典范对应分析(canonical correlation analysis,CCA)、envfit分析、Mantel及偏Mantel检验、方差分解分析(variation partitioning analysis,VPA)。其中，NMDS分析用于判定不同样品间浮游细菌群落结构的差异性，CCA用于研究环境因子对浮游细菌群落结构的影响，Mantel及偏Mantel检验用于探究环境差异与浮游细菌群落结构差异的相关性，VPA用于研究不同环境因子对浮游细菌群落差异的影响程度。

2 结果与讨论

2.1 水样理化指标分析(表1)

表1 莫愁湖和紫霞湖水样理化指标分析

Tab.1 Physicochemical parameters of water samples from Mochou Lake and Zixia Lake

依Thomas标准[40]：“富”级：无机氮>1.5 mg·L-1，TP>0.1 mg·L-1；“中-富”级：无机氮0.5～1.5 mg·L-1，TP 0.03～0.1 mg·L-1。从表1可以看出，莫愁湖的TN在4个季节都达到了“中-富”级水平，TP都达到了“富”级水平，而紫霞湖的TN在4个季节都达到了“富”级水平，TP则为“中-富”级水平；2个湖泊的TP在夏季明显升高(分别达到0.80 mg·L-1和0.10 mg·L-1)，莫愁湖的TP整体上高于紫霞湖；2个湖泊的TN整体而言比较稳定，均在夏季达到最高值(分别达到2.37 mg·L-1和4.78 mg·L-1)，紫霞湖的TN整体上高于莫愁湖。这是因为，莫愁湖作为景观湖泊，其主要污染源为生活污水和生活垃圾，污染程度更加严重；紫霞湖作为风景区的人工蓄水湖泊，污染程度相对较轻。

2.2 alpha多样性指数分析

根据T-RFLP图谱结果，分别计算不同季节莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落的alpha多样性指数，结果如图1所示。

图中不同的字母标注表示2个组有显著性差异(P<0.05，anova检验)

从图1 中Simpson指数(图1a、c)可以看出，春季莫愁湖和紫霞湖的浮游细菌群落的多样性均要显著低于其它3个季节。Shannon指数(图1b、d)显示，春季莫愁湖的浮游细菌群落的多样性要显著低于夏季和秋季，与冬季无显著性差异；而紫霞湖浮游细菌群落多样性要显著低于其它3个季节，这与沈烽等[26]的研究结果是一致的。

不同季节莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落的alpha多样性指数对比如图2所示。

图中不同的字母标注表示2个组有显著性差异(P<0.05，T检验)

从图2中Simpson指数和Shannon指数可以看出，莫愁湖和紫霞湖在春季、夏季和秋季的浮游细菌群落多样性无显著性差异，冬季的浮游细菌群落多样性有显著性差异。这个结果可能与2个湖泊不同的营养类型有关[24]。

2.3 不同季节浮游细菌群落结构差异

通过计算样品间T-RFLP的距离(Bray-Curtis距离)，采用NMDS分析方法探究不同季节莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构的可能差异，结果如图3所示。

图中每一个点表示一个样品

图3 不同季节莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构的NMDS分析

Fig.3 NMDS analysis of bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake in four seasons

从图3a可以看出，莫愁湖春季、冬季和夏秋季的点重叠很小，夏季与秋季的点重叠较大，春季与冬季的点则无重叠，表明莫愁湖夏季、秋季的浮游细菌群落结构比较相似，春季、夏秋季和冬季的浮游细菌群落结构有比较显著的差异。从图3b可以看出，紫霞湖夏季、秋季和冬季的点相对接近，春季的点相对独立，表明紫霞湖夏季、秋季和冬季的浮游细菌群落结构比较相似，春季的浮游细菌群落结构与其它3个季节有较明显的差异。

2.4 浮游细菌群落结构与环境因子的关系

2.4.1 CCA

莫愁湖与紫霞湖的数据CCA排序前四轴最大值分别为2.94和3.92，为了便于比较，因此均使用单峰模型[26]。使用CCA探究环境变量对浮游细菌群落结构的影响，其中环境因子用带箭头的直线表示，直线越长则此环境因子与浮游细菌群落结构的相关性越大，直线和排序轴的夹角越小则此环境因子与排序轴的相关性越大。如图4所示。

图4 莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构与环境因子的典范对应分析

从图4可看出，莫愁湖的排序轴1轴和2轴分别解释了11.27%和9.48%的样本变异，紫霞湖的排序轴1轴和2轴分别解释了10.66%和7.30%的样本变异。

2.4.2 envfit分析

使用envfit分析检验每个环境因子的显著性，结果如表2所示。

表2 环境因子的CCA排序轴的相关性分析

Tab.2 Correlation analysis of CCA ordination axises for environmental factors

注:显著水平基于1000次置换；***表示P<0.001，极显著；**表示P<0.01，较显著；*表示P<0.05，显著。下表同。

2.4.3 Mantel检验

使用Mantel检验分析样品浮游细菌群落结构差异与环境变量差异的相关性。样品间浮游细菌群落结构差异通过计算Bray-Curtis距离来确定，样品间环境变量差异通过欧氏距离来确定，结果如表3所示。

表3 浮游细菌群落结构和环境变量的Mantel检验

Tab.3 Mantel test for the bacterioplankton community structure and environmental variables

2.4.4 偏Mantel检验

偏Mantel检验是控制其它变量，分析一个变量与另一个变量的关系。浮游细菌群落结构和环境变量的偏Mantel检验结果如表4所示。

2.5 讨论

(1)通过T-RFLP技术研究了南京莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构随季节的变化。alpha多样性指数分析表明，不同季节湖泊浮游细菌群落的多样性指数是不同的。莫愁湖和紫霞湖的浮游细菌群落的Simpson指数在春季最低，而在夏季、秋季和冬季差异不大。这一方面是因为夏秋季节湖泊水体中的大型植物和浮游植物大量繁殖，光合作用产生的大量有机物为细菌自由生长繁殖提供了物质基础；另一方面是因为冬春季水体温度相对较低，抑制了细菌的新陈代谢和生长增殖速率，而夏秋季则相反[28]。2个湖泊春季、夏季和秋季的alpha多样性指数没有显著性差异，紫霞湖冬季alpha多样性指数要显著高于莫愁湖，主要原因可能是：莫愁湖作为景观湖泊受人类活动影响较大，一年四季均有污水排入[6]，导致莫愁湖一年四季均处在较高的营养状态；紫霞湖作为人工蓄水湖泊受人类活动影响较小，1月份是枯水期，紫霞湖在此期间山间外来水流入湖泊较少，菌群未能富集，水体的浮游细菌多样性相应较高，而4月份处于丰水期，在此期间有大量外来水流入湖泊，菌群富集，水体的浮游细菌多样性相应降低[42]。刘兰英等[42]对福州左海湖的研究，高程等[43]对北京城区湖泊浮游细菌的研究，邢鹏等[44]、秦伯强等[45]和Wu等[25]对太湖浮游细菌的研究也得到了类似的结论。

表4 浮游细菌群落结构和环境变量的偏Mantel检验

Tab.4 Partial Mantel test for the bacterioplankton community structure and environmental variables

(2)采用以Bray-Curtis距离为基础的NMDS分析探究莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构随季节的变化。结果表明，莫愁湖浮游细菌群落结构在夏季和秋季差异不大，而春季、冬季和夏秋季的浮游细菌群落结构差异较大，这与沈烽等[26]对太湖浮游细菌群落结构的研究结果是一致的；紫霞湖浮游细菌群落结构在夏季、秋季和冬季差异不大，春季与其它季节差异较大。

(3)运用CCA方法探究莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构与环境因子的关系。结果表明，莫愁湖和紫霞湖的温度、pH值对浮游细菌群落结构均有着极其重要的影响，营养物有一定影响但不如前两者，尤其是对于紫霞湖的影响。研究表明，浮游细菌群落结构和多样性与空间[46]、时间[42-43]、环境变量(如温度、pH值和营养物)有关[47]，这与本研究结果是一致的。Mantel检验结果表明，莫愁湖的温度差异和pH值差异对浮游细菌群落结构的差异有着极显著的影响(P<0.001)，莫愁湖的营养物差异的影响显著(P<0.05)，但紫霞湖的营养物差异的影响并不显著，这可能与2个湖泊的营养水平不同有关[48]。

研究表明，①在营养水平较低的湖泊中，营养物会通过“上行效应”直接影响水体浮游细菌群落的生长[18-19，49]。②pH值会显著影响湖泊水体浮游细菌群落结构和多样性[49-50]，一方面，不同梯度的pH值会不同程度地影响各类细菌的生长状况(包括绝灭、繁衍、种的形成等[51])，从而直接影响浮游细菌群落结构和多样性；另一方面，不同的pH值梯度会不同程度地影响湖泊生态系统中的其它环境因子，从而间接影响水体浮游细菌群落结构和多样性。③温度对水体浮游细菌群落结构具有选择作用，是影响湖泊浮游细菌群落结构的关键因子之一[52-54]。

本研究中，各采样点属于弱碱性环境，适合大部分细菌生长，同时也存在一定的pH值梯度，而温度在一年内的变化十分明显，因此会对浮游细菌群落结构有一定的选择性。

(4)T-RFLP技术具有分析精细、分析能力强、易于自动化、分辨率高和可重复性等优点[55]，被广泛应用于大范围长时间尺度的微生物群落结构研究[26]。但若不注意其诸多过程中的技术细节，有可能引起分析误差，导致无法完全准确地反映环境样品中细菌群落的结构和多样性信息。因而为了确保分析结果的真实可靠，在实验设计时需采用多个具有代表性的重复样品，使用相同方法重复提取各样品总DNA，提高分析结果的可靠性[56]。

3 结论

应用16S rRNA基因末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术和多元统计方法研究了南京莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构的季节性变化及其与环境因子的关系。结果表明，莫愁湖和紫霞湖的alpha多样性指数在夏季和秋季时最高，在春季和冬季时最低；紫霞湖冬季浮游细菌群落的alpha多样性指数显著大于莫愁湖。非度量多维尺度(NMDS)分析结果显示，莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构存在明显的季节性变化。Mantel检验、典范对应分析(CCA)表明，影响莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构最显著的环境因子是温度和pH值，营养物对莫愁湖和紫霞湖浮游细菌群落结构的影响程度取决于湖泊的营养水平。为进一步研究不同程度富营养化水体中的浮游细菌群落结构差异提供了帮助。

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Seasonal Variation of Bacterioplankton Community Structure and Its Relationship with Environmental Factors of Mochou Lake and Zixia Lake in Nanjing

CAO Xin-yi1,2,XU Hui-min1,2,WANG Si-chen1,2,HUANG Rui1,2,SHEN Feng1,2,HE Xiao-wei1,2,YU Zhong-bo1,2,ZHAO Da-yong1,2

(1.StateKeyLaboratoryofHydrology-WaterResourcesandHydraulicEngineering,HohaiUniversity,Nanjing210098,China;2.CollegeofHydrologyandWaterResources,HohaiUniversity,Nanjing210098,China)

Seasonal variation of bacterioplankton community structure and its relationship with environmental factors of Mochou Lake and Zixia Lake in Nanjing were studied by 16S rRNA terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP) technology and multivariate statistical methods.The results showed that,alpha-diversity indexes of bacterioplankton community from Mochou Lake and Zixia Lake were the highest in summer and autumn,and the lowest in spring and winter.The alpha-diversity index of bacterioplankton community from Zixia Lake was significantly greater than that from Mochou Lake in winter.Non-metric multidimensional scaling(NMDS) analysis showed that,bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake had a seasonal variation.Mantel test,canonical correlation analysis(CCA) showed the most significant environmental factors which affected the bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake were temperature and pH value.Effects of nutrient on bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake were depended on the nutrient levels in lake.Overall,this study provides a help to research difference of bacterioplankton community structure in various eutrophic waters.

Mochou Lake;Zixia Lake;bacterioplankton;community structure;seasonal variation;environme-ntal factor;multivariate statistics;terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP) technology

国家自然科学基金资助项目(41371098)，水文水资源与水利工程科学国家重点实验室专项研究经费资助项目(20145027312，20155019012)，中央高校基本科研业务费资助项目(2015B14214)

2016-07-07

曹新益(1993-)，男，江苏邳州人，硕士研究生，研究方向：水生态环境保护与修复，E-mail:76565886@qq.com；通讯作者：赵大勇，教授，E-mail:dyzhao@hhu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.004

曹新益，徐慧敏，王司辰，等.南京莫愁湖与紫霞湖浮游细菌群落结构的季节性变化及其与环境因子的关系[J].化学与生物工程，2016，33(12)：19-26，30.

Q 178.1 X 172

A

1672-5425(2016)12-0019-08