黑麦减数分裂染色体标本制作实验研究

2016-12-30丁海燕訾晓雪

麦类作物学报 2016年12期

关键词：品红盖玻片黑麦

丁海燕，訾晓雪

(大庆师范学院，黑龙江大庆 163712)

黑麦减数分裂染色体标本制作实验研究

丁海燕，訾晓雪

(大庆师范学院，黑龙江大庆 163712)

为探索一套适合本科生在有限的课堂时间内操作并且效果良好可用于后续的分带、原位杂交方面研究的减数分裂染色体标本制作技术，使用卡宝品红、醋酸洋红对黑麦花药材料进行染色，采用叔丁醇脱水揭片法和冰冻揭片法对制作好的临时装片进行揭片，明确不同染色方法及不同揭片方法对标本制作效果的影响。结果表明，卡宝品红染色制得的标本颜色饱满鲜艳，适合本科实验教学使用；醋酸洋红染色获得的标本颜色浅红，更适合原位杂交等研究使用。叔丁醇脱水揭片法在脱水过程中花粉材料易与载玻片分离，材料易丢失；低温冷冻揭片法保证材料完好，操作简单。使用卡宝品红染色与冷冻揭片法制得的减数分裂各个时期的永久标本，染色体图像清晰，分裂相动态连续，可用于实验教学，也可用于原位杂交等方面的研究。

黑麦；减数分裂；染色体标本

减数分裂过程中染色体行为的观察是本科生遗传学实验教学的重要内容，制得减数分裂各个时期的动态连续的染色体标本，是提高教学质量的重要手段[1]。同时，制作良好的减数分裂染色体标本，对原位杂交、染色体分带等方面的研究也尤为重要[2]。前人在减数分裂染色体标本制作方面的研究较多，如李森华[3]用卡宝品红染色和冰冻机冰冻揭盖片的方法，对黑麦减数分裂各时期的染色体行为进行了研究；段增强等[4]改进了传统植物细胞减数分裂染色体制片技术，探索了用醋酸洋红染色3～5 min，并反复加热，然后烘干揭片的制片方法。但是较多的工作集中在用于显带、原位杂交等方面的染色体制片研究上，而针对本科生实验教学的染色体标本制作方面的研究比较少，而且黑麦是遗传学实验的常用材料[5]，关于黑麦减数分裂染色体标本制作的研究非常少。因此，本研究以黑麦为材料，使用卡宝品红、醋酸洋红对其花药进行染色，采用叔丁醇脱水揭片法和冰冻揭片法对制作好的临时装片进行揭片，明确不同染色方法及不同揭片方法对标本制作效果的影响，旨在探索适合本科生在有限的课堂时间内操作并且效果良好可用于后续的分带、原位杂交方面研究的减数分裂染色体标本制作技术。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为胜利黑麦。

1.2 试剂

卡宝品红染液[6]:3 g碱性品红溶于100 mL 70%乙醇中，此为原液A。取原液A 10 mL，加入90 mL 5%的苯酚水溶液，充分混均后，置于37 ℃温箱中2～4 h，此为原液B。取原液B 55 mL，加入甲醛、冰醋酸各6 mL充分混匀，此为原液C。配置染液时，取原液C 10～20 mL，加入80～90 mL 45%冰醋酸和1 g山梨醇。

1%醋酸洋红染液[7]:150 mL 45%的冰醋酸，煮沸后停止加热，加入1.5 g洋红(进口分装)粉末，一边加热一边搅拌至完全溶解，当45%的冰醋酸的量减少时，再加入相应量的45%的冰醋酸，煮沸约30 min，煮沸时将生锈的小铁钉放入染色液一同煮。之后将染液在室温下静置冷却，冷却之后过滤，染液贮存于棕色瓶，贮存于4 ℃冰箱中。

叔丁醇脱水揭片法的四种溶液[8]:1、45%醋酸与95%乙醇以1∶1的比例混合；2、95%叔丁醇；3、95%乙醇与叔丁醇以1∶1的比例混合；4、叔丁醇。分别盛在编号为1～4的四个烧杯中。

其他药品:70%乙醇、95%乙醇、盐酸、45%冰醋酸、中性树胶。

1.3 方法

1.3.1 麦穗的选取与处理

黑麦旗叶还未完全展开，距离第一节大约10 cm时，剪取花苞，将麦穗取出，卡诺固定液中4 ℃固定24 h，70%乙醇冲洗3次，置于70%乙醇中，在4 ℃冰箱保存备用[9]。

1.3.2 花药的选择

在取材时应注意，同一穗上不同部位的小花中的花药分裂时期有所不同，同一小花中的花药所处的分裂期大致相同。在同一麦穗中一般以长在中部的小穗最先发育，依次向上向下推移，每一小穗中各个小花的发育顺序则由下向上推移，即第1朵小花比第2朵小花早一个分裂时期，但越到后来分裂时期越接近。如以花药长度来看，大致在3 mm左右时的花药应为黄绿色，绿色则太嫩，黄色则太老。同一朵小花中3个花药几乎处于同一分裂时期，一般选取较长的花药制片[10]。

1.3.3 花药的染色与制片

从固定的花序中按由下到上的顺序取几个小花，用镊子在每个小花中分别取出两个花药，一个放在1%醋酸洋红染液中，另一个放在70%乙醇中，并均于4 ℃冰箱保存。经醋酸洋红染色的花药要在至少一周后才可用于压片[11]，而在70%乙醇中的花药可以随时取出压片。70%乙醇中的花药压片方法如下:将花药取出后放在载玻片上，用刀片切割下一小段花药，先用竹签轻轻按压几下，挤出花粉母细胞，将剩余的花药放在另外一个载玻片上并滴加一滴45%醋酸防止干燥，将原载玻片上的一小段花药滴上一滴卡宝品红染液，染色3～5 min后加上盖玻片，将刀片夹在盖玻片与载玻片之间，左手食指按在盖玻片的左下角，右手持一竹签在花药周围敲击，待花药中的花粉母细胞分散后即可，之后把制片在酒精灯外焰上过几次，但加热时间不可过长，时间过长则容易使材料烤焦，时间过短则之后在揭片时容易使材料脱离载玻片[12-13]，加热后立即在盖玻片上覆两块滤纸，用拇指垂直按压制片[14]，注意在压片过程中不要让盖玻片移动。1%醋酸洋红染液中的花药压片方法如下:将染色一周的花药取出后，用刀片切取一小段花药，滴一滴45%醋酸后加上盖玻片，将刀片夹在盖玻片与载玻片之间，之后，用与上文同样的方法制片。

1.3.4 镜检及揭片

先在低倍镜下找到具有分裂相的花粉母细胞，然后依次转换到高倍镜观察辨认该时期位于减数分裂的哪个时期。分裂相较好的临时装片要制作成永久装片。首先要进行脱片，脱片的目的是使临时压制的片子的盖玻片与载玻片分离。本实验采用的脱片方法有两种，即冷冻揭片法和叔丁醇脱水揭片法。冰冻揭片法[15]:把临时压制的片子放在-80 ℃的冰箱内，使片子迅速冻结，2 h后用刀片迅速揭开盖片，以免片子上的水分融化，使材料丢失。叔丁醇脱水揭片法[16]:将临时装片的盖玻片那面朝下，倾斜放在1号烧杯中，让盖玻片自然脱落，然后用镊子夹取盖玻片和载玻片，再依次在2～4号烧杯的溶液中处理。在每个烧杯中分别浸泡5 min左右取出。

1.3.5 干燥及封片

在盖玻片与载玻片分离后，将载玻片有材料的一面朝上放置在培养皿中，于60 ℃的烘箱中干燥[17]。干燥10 h后，将一滴中性树胶滴在载玻片上的材料上，取一干净的盖玻片轻轻附于其上，平放即可，切记不可压片。做好的装片放在干净通风处进行干燥，待树胶干燥后，即为永久装片。

2 结果与分析

2.1 染色方法对标本制作效果的影响

实验比较了醋酸洋红染色和卡宝品红染色的效果。使用醋酸洋红染色所得的永久片在显微镜下观察时，染色体着色很浅，图像呈浅红色(图1A)。使用卡宝品红染色所得的永久片在显微镜下观察时，染色体着色很深，图像呈紫色，颜色鲜艳，易于观察(图1B)。醋酸洋红染色周期较长，一般至少7 d才能上色。卡宝品红染色时间很短，一般3～5 min即可，适合本科学生在遗传学实验课中使用。

2.2 揭片技术对标本制作效果的影响

实验比较了叔丁醇脱水揭片法与低温冷冻揭片法对标本制作效果的影响。叔丁醇脱水揭片法在许多文献中都有所提及，但是通过实验发现，此法不易操作、难度较大，在脱水过程中花粉细胞便与载玻片分离，最终没有通过这种方法得到永久片。低温冷冻揭片法效果很好，只需将临时装片压片后放入-80 ℃的冰箱中冷冻数小时之后取出揭片即可，而且方便、安全。实验所得的永久片全部由此法获得。

2.3 第一次减数分裂标本的制作

使用卡宝品红染色、醋酸洋红染色、低温冰冻揭片的方法制作了黑麦第一次减数分裂标本，效果良好。图2D为醋酸洋红染色的标本效果，图2中其他图像为卡宝品红染色的标本效果。

第一次减数分裂时，同源染色体发生联会，交叉互换。之后，同源染色体分开，非同源染色体自由组合。此时期可分为:前期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ。其中，前期Ⅰ又包括细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。细线期时染色质凝缩成可见的细线(图2A)。偶线期时同源染色体沿着纵长方向配对(图2B、图2C)。偶线期早期阶段和晚期阶段是动态连续的过程，但是学生在实验操作和观察时却往往不能同时看到，这样的变化过程呈现给学生，加深了对染色体动态变化的理解。粗线期同源染色体联会基本完成，每个二价体都能清晰可见，此时染色体比偶线期要短，粗线期较早阶段的染色体形态和较晚阶段的染色体形态差异较大(图2D、图2E)，较晚阶段的粗线期染色体形态与双线期的较早阶段很像，如果单独观察较难区分。双线期时联会复合体解体，同源染色体相互排斥，染色体出现或大或小的交叉(图2F)。终变期时染色体继续缩短变粗(图2G)。中期Ⅰ时染色体排布在赤道板上，且每个染色体颗粒中包含四条染色单体，中期Ⅰ(图2H、图2I)较早的阶段染色体形态与终变期的较难区分。后期Ⅰ时纺锤丝附着在着丝点上，同源染色体向两极移动(图2J、图2K)，此时可隐隐见到纺锤丝。末期Ⅰ时染色体达到两级，赤道板处形成细胞板，一个性母细胞分裂形成两个，每个新的细胞呈现月牙状(图2L)。

在实验教学课堂上，两个连续动态的染色体标本同时呈现给学生，学生会深刻理解减数分裂过程的动态连续性，会很容易区分和掌握它们的特征。

a:细线期；B:偶线期(早)；C:偶线期(晚)；D:粗线期(早)；E:粗线期(晚)；F:双线期；G:终变期；H:中期Ⅰ(早)；I:中期Ⅰ(晚)；J:后期Ⅰ(早)； K:后期Ⅰ(晚)；L:末期Ⅰ。

a:Leptotene stages；B:Zygotene stages(early)；C:Zygotene stages(late)；D:Pachytene stages(early)；E:Pachytene stages(late)；F:Bifilar stages；G:Diakineses；H:Metaphase Ⅰ(early)；I:Metaphase Ⅰ(late)；J:Anaphase Ⅰ(early)；K:Anaphase Ⅰ(late)；L:Telophase Ⅰ.

图2 第一次减数分裂的标本图像

Fig.2 Specimen images of meiosis Ⅰ

2.4 第二次减数分裂标本的制作

使用卡宝品红染色、醋酸洋红染色、低温冰冻揭片的方法制作了黑麦第二次减数分裂标本。图3D为醋酸洋红染色的标本效果，图3中的其他图像为卡宝品红染色的标本效果。

第二次减数分裂中，姐妹染色体分开，非姐妹染色单体自由组合。第二次减数分裂包括:前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ和末期Ⅱ。前期Ⅱ持续时间较短，表现为染色体逐渐缩短变粗(图3A)，每条染色体中都包着两条染色单体。中期Ⅱ时细胞内出现纺锤丝，每条染色体的着丝粒都排列在赤道板上，在显微镜下可见两个呈半月形的中期细胞相邻的排列在一起(图3B)。后期Ⅱ时姐妹染色单体分开，移向两级在显微镜下可见两个呈半月形的后期细胞相邻的排列在一起(图3C)。末期Ⅱ时姐妹染色单体移动到细胞的两级，在赤道板处形成细胞板，在显微镜下可见炸药包结构(图3D)，即形成了四个子细胞。

a:前期Ⅱ；B:中期Ⅱ；C:后期Ⅱ；D:末期Ⅱ。

a:Prophase Ⅱ；B:Metaphase Ⅱ；C:Anaphase Ⅱ；D:Telophase Ⅱ.

图3 第二次减数分裂的标本图像

Fig.3 Specimen images of meiosis Ⅱ

3 讨论

本实验选用醋酸洋红与卡宝品红分别对分裂期相近的花药染色，发现卡宝品红染色方法尤其适合本科学生实验，前人研究使用卡宝品红染色一般认为需要10～15 min，而且有的研究者主张花药材料要解离才染色效果好；本研究发现使用卡宝品红染色时材料上色迅速，大约3～5 min就可将花药染色，而且花药材料也不需要预先解离就能很好的染色，值得一提的是用这种方法制片时，不能用整个花药制片，要把黑麦花药切分成若干小段，这样就使得花药壁里的花粉母细胞散落出来，很容易上色，无需解离。

在揭片方法上本研究发现叔丁醇脱水揭片法在操作过程中极其容易丢失材料，造成观察的分裂相失真；低温冷冻揭片法能够保证材料的完好，利于研究与观察。有研究者用加热烘干的方法揭片，本研究对此种方法未进行试验，在今后的研究中进一步探讨。

黑麦为二倍体植物，体细胞有14条染色体，染色体数较少，减数分裂各时期的分裂相易于观察。而且黑麦花药比较大，在操作时容易选取，材料不易丢失。减数分裂各个时期动态连续的染色体标本的制作，对于学生正确了解染色体在减数分裂各时期的行为特点具有重要意义。制作良好的染色体标本也可用于后续的分带、基因定位等研究。

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Study on Experimental Specimen Making of Meiotic Chromosome of Rye

DING Haiyan，ZI Xiaoxue

(Daqing Normal University,Daqing,Heilongjiang 163712,China)

In order to establish a set of techniques for meiotic chromosome specimen making with simple procedures,glass slides for rye chromosomes were prepared by the improved method,using rye anthers as experimental materials,dyed by carbol fuchsin and the acetic acid magenta,and the meiosis of pollen mother cell of rye was observed under microscope and recorded by photograph.Two methods for coverslip removing(by the tertiary butyl alcohol and by freezing) were studied and compared.Specimens stained with carbol fuchsin are full of bright,suitable for undergraduate experimental teaching.Specimens dyed by acetic acid magenta are light red,more suitable for usinginsituhybridization,which will not affect the experimental results.Materials are easy to lose during the coverslip removing by the tertiary butyl alcohol,but the materials are in good condition during coverslip removing by freezing,with simple operation.Results showed that these permanent specimens stained with carbol fuchsin and coverslip removing by freezing were good,showing dynamic continuous phase.These specimens included two stages(meiosis Ⅰ and meiosis Ⅱ of rye) and all are dynamic process.They could be better used in the experimental teaching andinsituhybridization study.

Rye；Meiosis；Chromosome specimen