山东省小麦田看麦娘对甲基二磺隆的抗性及其基因突变

郭文磊，赵 宁，李 伟，白 霜，王金信

(山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271018)

山东省小麦田看麦娘对甲基二磺隆的抗性及其基因突变

郭文磊，赵 宁，李 伟，白 霜，王金信

(山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271018)

为明确山东省麦田看麦娘种群对甲基二磺隆的抗性情况及可能存在的抗性机理，本研究在临沂、日照等山东省看麦娘发生严重地区的小麦田共采集10个看麦娘种群，在温室条件下测定了其对甲基二磺隆的抗性以及对其他4种除草剂的敏感性，扩增和比对了靶标酶乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)基因部分片段的差异。结果表明，SDTC-4种群对甲基二磺隆具有高抗性，抗性倍数达30.1，其他种群对甲基二磺隆敏感，抗性倍数在1.0～1.8之间。对ALS基因片段测序发现，SDTC-4种群看麦娘ALS基因 197位氨基酸由脯氨酸(CCC)突变为丝氨酸(TCC)(P197S)，其他种群均未发现有突变产生。SDTC-4种群对啶磺草胺和氟唑磺隆产生了一定的交互抗性，在推荐剂量下死亡率分别为10.0%和13.3%。所有的看麦娘种群对精噁唑禾草灵和异丙隆敏感，推荐剂量下死亡率达100%。本研究是看麦娘对甲基二磺隆抗性在山东省的第一例报道，ALS基因P197S突变是第一次在看麦娘中被发现，该突变很可能是导致SDTC-4种群对甲基二磺隆产生抗性的重要原因之一。

看麦娘；甲基二磺隆；乙酰乳酸合成酶；抗性；基因突变

看麦娘(AlopecurusaequalisSobol.)是禾本科看麦娘属植物，在我国分布广泛，是我国农田十大害草之一[1-2]，其繁殖力强、种子量大，成熟后自行散落，容易经风、水流、机械等途径传播，群体竞争力强，导致作物严重减产[3-4]。作为山东省冬小麦田优势杂草，看麦娘在山东省鲁南等地区的稻麦轮作田危害十分严重[5]。

甲基二磺隆(mesosulfuron-methyl)，是由德国拜耳作物科学公司开发的一种磺酰脲类(sulfonylureas, SUs)除草剂，该药剂2004年在我国正式登记，广泛用于小麦田防除禾本科及部分阔叶杂草，其作用靶标为乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)。 ALS类除草剂还包括咪唑啉酮类(imidazolinones, IMIs)、嘧啶氧(硫)苯甲酸酯类(pyrimidinyl-thiobenzoates, PTBs)、三唑并嘧啶类(triazolopyrimidines, TPs)和磺酰胺羰基三唑啉酮类(sulfonyl-aminocarbonyl-triazolinones, SCTs)[6]。ALS类除草剂具有杀草谱广、用量低、对作物安全性高、对人畜低毒等优点，但其作用位点单一，极易导致抗药性的产生，截至目前全球已有158种杂草对该类药剂产生了抗性[7-8]。在我国，Bi 等[9]报道江苏省1个日本看麦娘(Alopecurusjaponicus)种群对甲基二磺隆的抗性水平达169倍。韩玉娇等[10]报道江苏、安徽部分菵草(Beckmanniasyzigachne)种群对甲基二磺隆产生了明显的抗性。另外，Guo等[11]和Xia等[12]分别报道了安徽、江苏小麦田看麦娘对甲基二磺隆的抗性，且其对精噁唑禾草灵产生了多抗性。

将杂草对除草剂的抗性机理一般分为靶标抗性(Target site resistance，TSR)和非靶标抗性(Non-target site resistance，NTSR)[13]。非靶标抗性是由于杂草对除草剂代谢能力的增强或吸收转运的减少，导致到达靶标位点的除草剂的量减少，从而使杂草得以存活[14-15]。非靶标抗性由复杂的多基因控制，目前国内外研究均较少。靶标抗性主要由于靶标酶特定位点发生氨基酸替代，导致对除草剂的敏感性降低。目前，已经证实杂草的ALS基因有8个位点(122、197、205、376、377、574、653、654)发生了27种氨基酸替代形式，这些突变可导致杂草对ALS类除草剂产生抗性[13, 16]。Guo等[11]报道了甲基二磺隆抗性看麦娘ALS基因574位点由色氨酸突变为亮氨酸(W574L)；Xia等[12]发现看麦娘种群对甲基二磺隆的抗性是由于ALS基因197位脯氨酸突变为苏氨酸(P197T)。ALS基因不同位点的突变可能产生不同的交互抗性谱，如574位点突变会导致杂草对所有5类ALS类除草剂产生抗性，而197位点突变会导致杂草对SU类除草剂产生高抗性，对其他4类ALS类除草剂的交互抗性则不尽相同。

山东省是我国小麦的主要种植区之一，看麦娘等禾本科杂草在山东省部分地区的小麦田危害严重。目前，在安徽、江苏等地区均已发现抗甲基二磺隆的看麦娘等禾本科杂草，但山东省冬小麦田杂草对该除草剂的抗性尚未见报道。本研究在山东南部等看麦娘发生严重区域的冬小麦田采集部分看麦娘种群，测定其对甲基二磺隆的敏感性差异，扩增和比对了抗性和敏感种群的ALS基因片段，并测定供试种群对其他除草剂的敏感性，以期为看麦娘的治理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 看麦娘种子

从山东郯城、东港、岚山、莱阳、莱西等地小麦田采集看麦娘种群共9个，分别编号为SDTC-1、SDTC-2、SDTC-3、SDTC-4、SDDG-1、SDDG-2、SDLS-1、SDLY-1、SDLX-1；另从山东泰安泰山区一处非耕地采集1个种群作为敏感对照，编号为SDTS-1。采集地点等具体信息见表1。

1.1.2 供试除草剂

30 g·L-1甲基二磺隆可分散油悬浮剂、69 g·L-1精噁唑禾草灵(fenoxaprop-p-ethyl)微乳剂，拜耳作物科学(中国)有限公司；7.5% 啶磺草胺(pyroxsulam)水分散粒剂，美国陶氏益农公司；70%氟唑磺隆(flucarbazone-sodium)水分散粒剂，日本爱利思达公司；50%异丙隆(isoproturon)可湿性粉剂，美丰农化有限公司。

表1 看麦娘种群采集地点和时间

Table 1 Location and time ofAlopecurusaequalispopulations collected

种群编号Population采样点Samplingsite经纬度Longitudeandlatitude采集时间CollectiontimeSDTC⁃1临沂市郯城县红花镇前苍村Qiancangvillage，Honghuatown，TanchengcountyofLinyiN：34°29′10″E：118°20′43″2013年6月June2013SDTC⁃2临沂市郯城县红花镇胡林村Hulinvillage，Honghuatown，TanchengcountyofLinyiN：34°28′47″E：118°19′23″2013年6月June2013SDTC⁃3临沂市郯城县红花镇袁堂村Yuantangvillage，Honghuatown，TanchengcountyofLinyiN：34°29′15″E：118°18′46″2013年6月June2013SDTC⁃4临沂市郯城县归昌乡归昌三村Guichangthirdvillage，Guichangtown，TanchengcountyofLinyiN：34°30′48″E：118°16′39″2014年6月June2014SDDG⁃1日照市东港区涛雒镇涛雒六村Taoluosixthvillage，Taoluotown，DonggangdistinctofRizhaoN：35°16′6″E：119°22′08″2013年6月June2013SDDG⁃2日照市东港区涛雒镇涛雒七村Taoluoseventhvillage，Taoluotown，DonggangdistinctofRizhaoN：35°16′40″E：119°22′03″2013年6月June2013SDLS⁃1日照市岚山区碑廓镇下湖村Xiahuvillage，Beikuotown，LanshandistinctofRizhaoN：35°12′07″E：119°09′27″2013年6月June2013SDLY⁃1烟台市莱阳市照旺庄镇叶家泊村Yejiapovillage，Zhaowangzhuangtown，LaiyangcountyofYantaiN：36°54′28″E：120°45′05″2013年6月June2013SDLX⁃1青岛市莱西市南墅镇北墅村Beishuvillage，Nanshutown，LaixicountyofQingdaoN：37°03′12″E：120°19′59″2014年6月June2014SDTS⁃1泰安市泰山区南上高乡黄家庄村Huangjiazhuangvillage，Nanshanggaotown，TaishandistinctofTaianN：36°10′36″E：117°10′12″2014年6月June2014

1.2 试验方法

1.2.1 看麦娘对甲基二磺隆的抗性测定

采用温室盆栽整株水平测定法[17]进行看麦娘对甲基二磺隆的抗性测定。从各种群中，分别选取均匀一致的看麦娘种子，置于含30 mL 6 g·L-1的植物细胞和组织培养用琼脂(Duchefa Biochemie B.V公司)的培养皿中，每皿加灭菌水3 mL保持湿润；将培养皿放入智能光照培养箱中催芽(光/暗比为12 h/12 h，温度20 ℃/15 ℃)。选取芽长1 cm左右的幼苗，移植到盛有壤土的直径12 cm的塑料花盆中，每盆15株，置于可控温室中培养(18～25 ℃，湿度50%～70%，自然光照)。2～3叶期间苗，每盆留生长状况一致的看麦娘10株。3～4叶期时采用ASS-4自动控制农药喷洒系统(北京盛恒天宝科技有限公司)进行茎叶喷雾处理，喷液压力275 kPa，喷液量450 L·hm-2。在预试验的基础上，设定甲基二磺隆有效成分(下同)施用剂量为：抗性(R)种群，0、3、9、27、81、243、729 g·hm-2；敏感(S)种群，0、0.1、0.3、1、3、9、27 g·hm-2。

处理后21 d剪取地上部分，在80 ℃条件下烘干72 h至恒重，称量干重并记录。每处理3次重复，试验共进行2次。用SPSS 17.0统计分析软件对两次试验结果进行ANOVA分析，合并后的结果采用SigmaPlot 12.5软件进行4参数非线性回归[18]分析：

Y=C+(D-C)/[1+(X/GR50)b]

式中，Y为各除草剂处理剂量下看麦娘干重占空白对照的百分比；C为剂量反应下限；D为剂量反应上限；X为除草剂用量；b为斜率。利用该公式计算出GR50值，再利用R、S种群的GR50计算出抗性倍数RI= GR50(R)/GR50(S)。RI分级标准参考Beckie等[19]方法：敏感(RI<2)，低抗(RI=2～5)，中抗(RI=6～10)，高抗(RI=11～100)，极抗(RI>100)。

1.2.2 基因组DNA提取

从看麦娘R、S种群分别随机选取30株进行基因组DNA提取。3～4叶期时，每植株剪取约0.1 g幼嫩叶片组织，按植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明书提取DNA。其中，R种群为单株提取，共得到30个DNA样品；S种群均为3株混合提取，每个S种群得到10组DNA样品。提取的总DNA样品立即用于PCR扩增或放入-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 引物设计与合成

参考GenBank登记的大穗看麦娘AlopecurusmyosuroidesALS(AJ437300.2)基因序列，利用Primer Premier 5.0软件，设计引物用于看麦娘ALS基因检测，所扩增ALS基因片段不包含内含子，覆盖所有已报道的ALS抗性突变位点。另设计引物AL-F2、AL-F3用于扩增片段的测序，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表2。

表2 扩增看麦娘ALS基因片段的引物

Table 2 Primers used for ALS gene amplification fromAlopecurusaequalis

引物Primer序列(5′⁃3′)Sequence(5′⁃3′)退火温度Annealingtemperature/℃用途Usage片段大小Productsize/bpAL⁃F1CGTCGCCTTACCCAAACCTAC59．6PCR扩增及测序PCRandALSsequencing1859AL⁃R1RTCCTGCCATCACCWTCCAAL⁃F2ATTGCCCGCCTTCCTAAGCCALS测序ALSsequencingAL⁃F3TCATTGCCACTGGTGTTGGGCALS测序ALSsequencing

引物序列中R、W均为简并碱基，R:A/G, W:A/T。

In the primer sequence, R and W are degenerate bases, R:A/G, W:A/T.

1.2.4 看麦娘ALS基因片段克隆与测序

ALS基因片段扩增均采用50 μL反应体系：34.5 μL ddH2O、5 μL 10× EasyTaq缓冲液、4 μL dNTP、2 μL引物AL-F1、2 μL引物AL-R1、0.5 μL EasyTaqDNA 聚合酶、2 μL 基因组DNA模板，缓冲液、dNTP、DNA聚合酶均购自北京全式金生物技术有限公司。采用T100 Thermal cycler PCR仪(美国伯乐公司)进行扩增，反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，59.6 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min， 35个循环；72 ℃终延伸10 min。

取扩增产物5 μL于1.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，将含目的条带的PCR扩增产物用EasyPure PCR Purification Kit(北京全式金生物技术有限公司)纯化后测序(上海生工)。

将测序所得序列用DNAman 5.2.2软件进行翻译，得到相应的氨基酸序列；对氨基酸序列进行比对分析。本研究中，所有看麦娘ALS氨基酸序列位数均参照拟南芥ArabidopsisthalianaALS(NM-114714.2)氨基酸序列全长进行比对。

1.2.5 看麦娘对其他除草剂的敏感性测定

采用单剂量测定所采集种群对ALS类除草剂啶磺草胺、氟唑磺隆、ACCase类除草剂精噁唑禾草灵和取代脲类除草剂异丙隆的敏感性，以清水处理为对照。4种除草剂有效成分(下同)施用剂量分别为：啶磺草胺10.55 g·hm-2，氟唑磺隆31.5 g·hm-2，精噁唑禾草灵62.1 g·hm-2，异丙隆900 g·hm-2。看麦娘培养及喷药方法同1.2.1。处理后21 d记录每盆看麦娘植株死亡数；剪取地上部分称量干重，计算死亡率和干重抑制率。

死亡率=(对照杂草株数-处理杂草株数)÷对照杂草株数×100%

1.3 数据处理

试验数据用DPS 7.05进行处理，差异性分析采用邓肯新复极差法(DMRT)。

2 结果与分析

2.1 不同看麦娘种群对甲基二磺隆的抗性水平

如表3所示，10个被测看麦娘种群中有9个对甲基二磺隆都较为敏感，GR50值在1.3～2.4 g·hm-2之间；只有采自山东郯城的SDTC-4种群对甲基二磺隆具有高抗性，其GR50值达39.1 g·hm-2，远大于推荐剂量(9 g·hm-2)，与敏感种群SDTS-1相比抗性倍数达30.1倍。说明甲基二磺隆在推荐剂量下已不能有效防治SDTC-4看麦娘种群。试验结果与田间观察结果一致。

2.2 看麦娘ALS基因片段测序

对看麦娘ALS基因片段进行扩增后，得到长度为1 859 bp的ALS基因片段，该ALS基因序列与亲缘关系较近的大穗看麦娘相应基因的同源性达96.2%。将翻译后的氨基酸序列与拟南芥进行比对，结果显示在产生抗性的SDTC-4种群中，ALS氨基酸序列的197位(以拟南芥ALS全长氨基酸序列为标准)氨基酸密码子由CCC突变为TCC，导致脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)(图1)。所测SDTC-4种群的30株看麦娘均产生上述突变，对其测序峰图进行分析发现，30株中有18株是纯合型突变(即197位密码子为TCC)，另有12株为杂合型(即197位密码子为CCC/TCC)。SDTC-4种群中未发现其他位点的突变，所有敏感型种群均未发现已证实的突变。

表3 不同看麦娘种群对甲基二磺隆的抗性水平

Table 3 Resistance level to mesosulfuron-methyl in different populations ofAlopecurusaequalis

种群Population回归方程参数RegressionparameterCDbGR50/[g(a．i)·hm-2]抗性倍数RISDTC⁃122．2(4．0)86．1(3．6)1．2(0．3)1．9(0．3)1．5SDTC⁃218．4(3．2)92．5(4．6)0．8(0．2)2．4(0．9)1．8SDTC⁃321．8(0．7)96．2(0．7)1．3(0．1)1．8(0．1)1．4SDTC⁃423．8(2．1)91．7(2．4)1．4(0．2)39．1(3．7)30．1SDDG⁃122．4(2．8)79．8(2．7)2．1(0．5)1．9(0．3)1．5SDDG⁃215．4(7．5)90．3(7．3)0．8(0．3)1．8(0．5)1．4SDLS⁃129．4(1．9)86．0(2．1)1．5(0．2)1．5(0．2)1．2SDLY⁃125．7(2．2)86．9(2．4)1．1(0．2)1．6(0．2)1．2SDLX⁃123．8(0．9)84．1(1．1)1．3(0．1)1．4(0．1)1．1SDTS⁃121．5(1．5)80．5(1．9)1．2(0．1)1．3(0．1)1．0

括号内数据为标准误。

Standard errors(SE) are in parentheses.

方框表示种群中ALS的197位氨基酸。

Boxed codons indicate 197 amino acid in ALS.

图1 不同看麦娘种群ALS部分氨基酸序列

Fig.1 Partial amino acid sequences of ALS gene from differentAlopecurusaequalispopulations

P197S突变在地肤(Kochiascoparia)、硬直黑麦草(Loliumrigidum)、虞美人(Papaverrhoeas)等杂草中已有报道，该突变可使得抗性杂草对磺酰脲类除草剂产生高水平或极高水平(RI>100)的抗性[17]。本研究中，SDTC-4种群对甲基二磺隆的高抗性很可能与其ALS基因的P197S突变有关。

2.3 看麦娘对其他除草剂的敏感性

为了确定山东省看麦娘种群对其他麦田禾本科杂草常用除草剂啶磺草胺、氟唑磺隆、精噁唑禾草灵和异丙隆的敏感性，以及抗性种群SDTC-4是否对其他ALS类除草剂产生了一定的交互抗性，本研究采用单剂量测定的方法进行了试验。

如表4所示，采自山东省的10个看麦娘种群，在精噁唑禾草灵(62.1 g·hm-2)和异丙隆(900 g·hm-2)推荐剂量处理下，死亡率均达100%，干重抑制率在81.9%～84.3%和89.9%～92.5%之间。另外，大多数看麦娘种群的植株在啶磺草胺(10.55 g·hm-2)和氟唑磺隆(31.5 g·hm-2)处理下均死亡，而SDTC-4种群死亡率仅为10.0%和13.3%，干重抑制率为35.4%和42.9%。

上述结果表明，山东省大多数看麦娘种群对精噁唑禾草灵、异丙隆、啶磺草胺和氟唑磺隆依然敏感，这4种除草剂仍可用于防除麦田看麦娘。SDTC-4种群对甲基二磺隆产生抗性的同时，对啶磺草胺和氟唑磺隆也产生了一定的交互抗性，已不适于采用这2种药剂对其进行防治。

表4 不同看麦娘种群对其他4种除草剂的敏感性

Table 4 Sensitivity of differentAlopecurusaequalispopulations to four kinds of herbicide

%

同列数据后的不同字母表示种群间差异显著(P<0.05)。

Different letters following values within same column mean significant difference(P<0.05).

3 讨 论

本研究所测的山东省10个看麦娘种群中，SDTC-4种群对甲基二磺隆产生了高水平抗性，抗性倍数达30.1倍，其他种群对甲基二磺隆表现敏感。SDTC-4种群对甲基二磺隆抗性的产生可能与其用药历史有关。该地区已连续使用甲基二磺隆防治看麦娘等禾本科杂草多年。据报道，ALS类除草剂使用不到10次即可导致杂草对其产生抗性[19]。目前在世界范围内，对ALS类除草剂产生抗性的杂草数目在全部抗性杂草中居第一位[8]。SDTC-4种群抗性纯合植株约占60%，说明抗性在该地块可能已产生多年。看麦娘是二倍体植物，且可以通过异花授粉(40%)方式完成授粉[20]。因此，抗性相关基因很容易通过花粉从抗性植株传播到其他植株，从而使得抗性基因在田间很快蔓延开来。种植方式及不合理的施药方式也有助于抗性的产生和传播。在施药时随意提高剂量[21]，甚至在同一个生产季度内施用2～3次同种或同类的除草剂可能是加快抗性种群产生的主要原因。据黄世霞[1]报道，看麦娘在0～5 cm的浅土层适宜萌发，2 cm时萌发率最高，随着埋藏深度增加萌发率显著降低。因此，除了利用除草剂进行化学除草外，可有针对性地采取深耕等措施对看麦娘进行防治。

本研究中，SDTC-4看麦娘种群植株的ALS基因产生了P197S突变，该突变在至少20种杂草中已被证实可导致对ALS除草剂的抗性[19]，因此P197S突变很可能与该种群对甲基二磺隆的抗性有关。ALS 基因197位点突变导致杂草对除草剂产生抗性的同时，一般不会对杂草的其他生物学特性带来明显影响，除草剂选择压消失后，抗性植株在种群中所占比例并不会降低。Yu等[22]研究了P197S突变对ALS酶动力学方面的影响，发现P197S突变对ALS功能几乎没有影响，这可能是该突变形式普遍存在的一个原因。

不同的突变位点，或者同一突变位点的不同突变方式，其交互抗性谱也不尽相同[19]。本研究发现抗性看麦娘种群(SDTC-4)对尚未使用过的除草剂啶磺草胺和氟唑磺隆已产生了抗性，这与前人的研究相一致[13,16,19]；精噁唑禾草灵和异丙隆仍可用于防治小麦田看麦娘。为延缓抗药性的发生，在生产实践中应选择不同种类的除草剂轮换使用或混用，避免单一、长期使用某类除草剂。考虑到多抗性看麦娘已有相关报道，应尽量避免连续使用某单一类型的除草剂。

本研究初步明确了山东省部分地区看麦娘对甲基二磺隆的抗性水平，发现SDTC-4种群对甲基二磺隆产生了高水平的抗性，且对啶磺草胺和氟唑磺隆具有抗性，其ALS基因的P197S突变应该是其产生抗性的主要原因之一。本文是山东省有关甲基二磺隆抗性的第一例报道，P197S突变则是在看麦娘中第一次被发现。本研究只从靶标抗性角度对其抗性机理进行了研究，有必要从靶标酶活性和代谢酶等角度对其抗性机理进一步研究。

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Resistance of Shortawn Foxtail(Alopecurus aequalis Sobol.) to Mesosulfuron-methyl in Wheat Fields in Shandong Province

GUO Wenlei, ZHAO Ning, LI Wei, BAI Shuang, WANG Jinxin

(College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong 271018, China)

In order to examine the resistance level and the potential resistance mechanism ofAlopecurusaequalisto mesosulfuron-methyl, we collected ten populations from the wheat fields in Linyi, Rizhao and other places of Shandong province. Whole-plant dose-response experiments were conducted to evaluate the mesosulfuron-methyl resistance levels and susceptibilities to the other four herbicides in the greenhouse. Acetolactate synthase(ALS) gene fragments were amplified, sequenced, and compared between the resistant and susceptible populations. The results showed that SDTC-4 population displayed high level resistance to mesosulfuron-methyl, and the resistance index(RI) was 30.1. Oppositely, all the other populations were still susceptible to mesosulfuron-methyl, with RI 1.0-1.8. Sequencing results showed that the mutation of proline(CCC) to threonine(TCC) existed in ALS gene of SDTC-4 population, but there were no mutations in other populations. The SDTC-4 population was also cross resistant to pyroxsulam and flucarbazone-sodium, with the mortality rate 10.0% and 13.3% at the recommended field rate, respectively. AllA.aequalispopulations could still be controlled by fenoxaprop-p-ethyl and isoproturon, with the mortality rate up to 100% at the recommended field rate. This was the first report about mesosulfuron-methyl resistance in Shandong province, and P197S mutation of ALS was also firstly reported inA.aequalis. The P197S mutation was very likely one of the key reasons resulting in mesosulfuron-methyl resistance of SDTC-4 population.

Alopecurusaequalis; Mesosulfuron-methyl; ALS; Resistance; Gene mutation

时间：2016-12-07

2016-05-12

2016-06-20

国家公益性行业(农业)科研专项(201303031)；国家自然科学基金项目(31471787)

E-mail：nongzhida@126.com 通讯作者：王金信(E-mail:wangjx@sdau.edu.cn)

S512.1；S432

A

1009-1041(2016)12-1688-07

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161207.1751.040.html