人工栽培蛹虫草致病木霉CCBH-M2的鉴定及生物学特性

李 娟，刘晓红，宋 洁，李 莉

(1.辽东学院 农学院，辽宁 丹东 118003；2.辽东生物产业研究所，辽宁 丹东 118003)

人工栽培蛹虫草致病木霉CCBH-M2的鉴定及生物学特性

李 娟1, 2，刘晓红1, 2，宋 洁1, 2，李 莉1

(1.辽东学院 农学院，辽宁 丹东 118003；2.辽东生物产业研究所，辽宁 丹东 118003)

自人工栽培蛹虫草培养料中分离得到1株致病木霉CCBH-M2，通过对其进行形态学鉴定及ITS序列系统发育分析，确定该木霉菌株为钩状木霉Trichodermahamatum(Bon.)Bain.。实验对该致病菌进行了生物学特性研究，结果表明，温度、pH值及培养料含水量对该钩状木霉生长影响显著(P<0.05)，其最适生长温度为26 ℃，最适pH值为6.0，培养料最适含水量为50 %～60 %。该研究结果是钩状木霉对人工栽培蛹虫草具有致病性的首次报道。

蛹虫草；致病木霉；钩状木霉；生物学特性

蛹虫草Cordycepsmilitaris(L.: Fr.)Link，属虫草科Cordycipitaceae，虫草属Cordyceps[1]，是珍贵的食药用真菌。该菌含虫草素、多糖、虫草酸、超氧化物歧化酶等多种生物活性成分，具有抗肿瘤、抑菌、提高免疫力、清除自由基等功效[2]。蛹虫草子实体已经实现规模化人工栽培，然而在栽培过程中，常发生病害。食用菌病害是指在栽培过程中，食用菌受到其他有害微生物的侵染，其正常的生长发育受到影响和抑制，导致菌丝体和子实体异常甚至死亡，对食用菌生产造成损失的现象，引起食用菌病害的微生物主要包括真菌、细菌及病毒[3]。

木霉TrichodermaPers.属于半知菌类的丝孢纲Hyphomycetes，丝孢目Hyphomycetales，丛梗孢科Moniliaceae，其有性阶段若发现一般为子囊菌门Ascomycota，肉座菌目Hypocreales，肉座菌科Hypocreaceae的肉座菌属HypocreaFr.[4-5]。木霉是香菇、平菇、金针菇、木耳等食用菌生产中主要的竞争性杂菌和病原菌，对多种食用菌子实体具有很强的寄生性，常在食用菌的制种和栽培过程中污染培养料和菌丝体，影响产品质量并造成减产[6]。根据调查，木霉亦是蛹虫草栽培过程中的常见真菌病害，一旦发病会造成减产，甚至绝收。但至今尚未见关于蛹虫草木霉病害病原菌的系统研究报道。

本文自被木霉侵染的蛹虫草栽培料中分离木霉菌株，根据形态学特征和ITS序列分析确定其种属，并研究了温度、pH值和培养料含水量对木霉菌株生长的影响，以期为该菌的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 木霉菌株CCBH-M2分离自辽宁省丹东市金山虫草合作社感染木霉的蛹虫草栽培盒，现保存于辽东学院农学院微生物学实验室。

1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯200.0 g、葡萄糖10.0 g、琼脂20.0 g、水1000 mL；小麦培养基：小麦70 %、蚕蛹粉23 %、蔗糖5 %、蛋白胨1.5 %、酵母粉 0.5 %、VB1微量、含水量60 %。

1.1.3 分子生物学试剂 真菌基因组DNA快速抽提试剂盒、引物ITS1/ITS4、TaqPCR Master Mix (2x，without dye)、DNA Marker(D2000)、6×loading bufffer均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株CCBH-M2的形态学鉴定 将木霉菌株CCBH-M2活化后，用直径0.6 cm的打孔器制备菌饼，接种至PDA平板中央，28 ℃培养5 d，每天观察菌落形态、颜色等性状。采用插片法培养菌株CCBH-M2，具体方法为：在距离菌饼2 cm处，将灭菌盖玻片以45°角插入培养基中，28 ℃培养。5 d后用镊子取出盖玻片，有菌面朝上置于载玻片上，显微镜下观察孢子、分生孢子梗及瓶梗的形态特征。按照杨合同[7]的分类方法对菌株进行形态学鉴定。

1.2.2 菌株CCBH-M2的ITS序列分析 参照潘力[8]方法培养菌株CCBH-M2获得菌丝体，按照基因组DNA快速抽提试剂盒的步骤要求提取木霉菌株的基因组DNA，采用通用引物(ITS1: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG- 3’；ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3’)进行ITS序列的PCR扩增，扩增体系(50 μl)：1×TaqPCR Master Mix 25 μl，DNA模板2 μl(0.1～10 ng)，引物(10 μmol/L)各2 μl，ddH2O 19 μl。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测后于-20 ℃冰箱保存，送至生工生物工程(上海)有限公司进行纯化，双向测序并拼接输出全序列。通过NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中的Blast检测并下载已测序列的相似序列和参考序列，运用ISTH(www.isth.info)数据库中的TrichOKey2.0[9]检测下载序列的准确性。运用软件ClustalX(Version 1.83)对多序列进行比对。运用分析软件Mega6.06中的邻位相连法进行系统发育树构建。

1.2.3 菌株CCBH-M2的生物学特性研究 (1)温度对菌株CCBH-M2生长的影响：菌株CCBH-M2在PDA平板活化后，用直径0.6 cm的无菌打孔器制备菌饼，接种至直径9.0 cm的PDA平板中央，分别置于20、24、26、28、30、32、35、40 ℃的培养箱中培养，每个处理设3个重复。培养5 d后用十字交叉法测量菌落直径。

(2)pH值对菌株CCBH-M2生长的影响： PDA培养基灭菌前用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液调整pH值分别至2、3、4、5、6、7、8、9、10。按照(1)中的方法接种木霉菌株CCBH-M2，在最适温度下培养，每个处理设3个重复。5 d后用十字交叉法测量菌落直径。

(3)培养料含水量对菌株CCBH-M2生长的影响：培养料为小麦培养基，按照吴小平[10]的方法，先将小麦烘干，再按比例加水拌料，配制成含水量分别为45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %的培养料，自然pH值，等量分装于20 mm×200 mm的试管中，灭菌后接种木霉菌株CCBH-M2，在最适温度下培养，每个处理设3个重复。5 d后测量试管中菌丝生长前端至培养料表面的距离，计算菌丝生长速度。

儒家思想之内涵、处事原则及方式，无不体现着对经与权的阐释。权，从字面意思来理解是变化，似乎与原则相悖，但却是对经的完美补充，于是便有君子之中庸，有经有权，小人反中庸。权，这一尺度生于人心权衡机能，生成固定之经后，又可以反过来帮助人在具体情境中进行尺度的判断和运用。

1.2.4 数据分析 试验数据整理及作图采用Excel(Word2003)。运用软件SPSS 18.0对试验数据进行单因素方差分析，差异显著性分析采用邓肯氏新复极差法。

2 结果与分析

2.1 病害症状

菌株CCBH-M2的侵染主要出现在蛹虫草栽培的转色提温阶段。发病初期，被木霉菌株CCBH-M2侵染的蛹虫草培养料长出白色菌丝，生长较快。5～7 d后，病原菌产生黄绿色孢子，菌丝和孢子覆盖整个培养料。蛹虫草菌丝和子实体的生长完全被病原菌抑制，导致子实体难以形成或子实体矮小畸形，采收期蛹虫草子实体出现倒伏，造成产量大减。

图1 菌株CCBH-M2的菌落形态Fig.1 Colony of strain CCBH-M2

图2 菌株CCBH-M2的分生孢子梗及瓶梗(×400)Fig.2 Conidiophores and phialides of strain CCBH-M2

图3 菌株CCBH-M2的分生孢子(×1000)Fig.3 Conidia of strain CCBH-M2

2.2 菌株CCBH-M2的形态特征

菌株CCBH-M2在PDA平板上，生长较慢，菌落呈白色，菌丝稀疏，7～10 d后产生黄绿色分生孢子，菌落背面无色(图1)。

图4 菌株CCBH-M2的ITS 序列PCR产物电泳图Fig.4 ITS amplification electrophoresis of strain CCBH-M2

分生孢子梗具不规则分枝，波状弯曲，明显延长成不育枝，瓶梗椭球形，分生孢子黄绿色，表面光滑，椭圆形，3.8～4.0 μm×2.2～2.5 μm(图2～3)。

对照《木霉分类与鉴定》[7]及孙军[11]和张广志[12]的木霉分类检索表，菌株CCBH-M2的形态学特征与已知的钩状木霉Trichodermahamatum(Bon.)Bain.一致，故将其初步鉴定为钩状木霉。

2.3 菌株CCBH-M2的ITS序列分析

以菌株CCBH-M2的基因组DNA为模板，对其ITS片段进行PCR扩增，获得600 bp左右的特异性片段(图4)。经测序并拼接，获得长度为561 bp的碱基序列(图5)。将所测序列在NCBI数据库中进行Blast序列检索，运用ISTH数据库中的TrichOKey2.0对下载序列的准确性进行检测。选取其中5个准确、典型菌株的ITS序列，以产黄青霉PenicilliumchrysogenumThom和白地霉geotrichumcandidumLink为外群构建系统发育树，进行系统发育分析(图6)。结果表明，菌株CCBH-M2与T.hamatum聚类在一个分支上。因此，结合形态特征及ITS序列系统发育分析结果，将菌株CCBH-M2鉴定为钩状木霉T.hamatum。

图5 菌株CCBH-M2的ITS 序列Fig.5 ITS sequence of strain CCBH-M2

图6 基于菌株CCBH-M2 ITS 序列构建的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of CCBH-M2and related strains

图7 不同温度对菌株CCBH-M2生长的影响Fig.7 Effects of different temperature on strain CCBH-M2

2.4 菌株CCBH-M2的生物学特性

2.4.1 温度对菌株CCBH-M2生长的影响 图7表明，温度对其生长影响显著(P<0.05)，菌株CCBH-M2的菌落直径随着温度的升高呈现先增长后降低的趋势，当温度为40 ℃时，该菌的生长完全受到抑制。在26 ℃下菌株CCBH-M2菌落直径显著大于其它处理组(P<0.05)，表明该菌的最适生长温度为26 ℃。

2.4.2 pH值对菌株CCBH-M2生长的影响 如图8所示，pH对菌株CCBH-M2的生长影响显著(P<0.05)，其菌落直径随着pH值的升高同样表现出先增大后降低的趋势，当pH值为6时，菌落直径显著高于其它处理组(P<0.05)，表明该菌的最适生长pH值为6，喜微酸环境。

2.4.3 培养料含水量对菌株CCBH-M2生长的影响 从图9可知，培养料含水量在50 %～60 %，测试菌株具有较高的生长速度，且此范围内各组间差异不显著(P>0.05)，此范围即为木霉菌株CCBH-M2培养料的最适含水量。当含水量过低(45 %)和过高(>70 %)时菌丝生长较慢，且试验过程中观测到含水量低产孢量大，含水量高产孢能力下降。

图8 不同pH值对菌株CCBH-M2生长的影响Fig.8 Effects of different pH value on strain CCBH-M2

图9 培养料含水量对菌株CCBH-M2生长的影响Fig.9 Effects of different water content on strain CCBH-M2

3 讨 论

据报道，危害香菇、平菇、金针菇、木耳等食用菌的木霉种类主要包括绿色木霉TrichodermaviridePers.、深绿木霉T.atroviride、康氏木霉T.koningiiOudem、哈茨木霉TrichodermaharzianumRifai、棘孢木霉TrichodermasperellumSamuels，Lieckfeldt & Nirenberg等[6,10,13～15]，而对蛹虫草致病木霉的研究则至今尚未见相关报道。本研究自人工栽培蛹虫草培养料中分离到一株致病木霉，结合形态学特征和ITS序列分析确定其为钩状木霉。在对该菌进行ITS序列分析时，常规的方法是利用NCBI提供的搜索工具BLAST进行相似序列检索，但该方法对木霉种类鉴定存在明显的缺陷，因为该数据库中大约40 %的木霉种类未经鉴定确认，或者在种的水平上鉴别错误[16]。因此，通过该方法获得的相似序列可信度低。而ISTH数据库是国际真菌分类委员会(国际微生物学会联合会)的木霉专门委员会利用修订和确认的序列数据建立了一个全自动的木霉种类鉴定方法[4]。本研究将Blast获得相似序列，通过ISTH数据库中的TrichOKey2.0进行准确性测定后，结合两个数据库的信息，选取准确典型的序列进行系统发育树构建，从而对木霉菌株进行可靠的鉴定。

钩状木霉的生物学特性研究显示，其生长的最适温度为26 ℃，最适pH值为6.0，最适培养料含水量为50 %～60 %。可见高温、高湿及弱酸性环境利于该菌的生长，因此该病原菌易发生于蛹虫草栽培的转色提温阶段。本研究结果为蛹虫草生产栽培过程中对该致病菌采取有效的防治措施提供了重要的理论依据。

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(责任编辑 李 洁)

Identification of PathogenicTrichodermaCCBH-M2 from CultivatedCordycepsmilitarisand Its Biological Characteristics

LI Juan1, 2, LIU Xiao-hong1, 2, SONG Jie1, 2, LI Li1

(1. Agricultural College, Eastern Liaoning University, Liaoning Dandong 118003, China；2. Institute of Applied Biology, Eastern Liaoning University, Liaoning Dandong 118003, China)

A pathogenicTrichodermastrain CCBH-M2 was isolated from culture material of cultivatedCordycepsmilitaris. The morphological characteristics and phylogenetic analysis showed that strain CCBH-M2 wasTrichodermahamatum(Bon.)Bain. The biological characteristics ofT.hamatumwere studied and the results showed that temperature, pH value and water content of the culture medium significantly influenced the growth of strain CCBH-M2(P<0.05), and its optimum growth temperature was 26 ℃, the optimum pH value was 6.0 and the optimum water content of culture materials was 50 %-60 %. The result was the first report ofT.hamatumpathogenicity on cultivatedC.militaris.

Cordycepsmilitaris; PathogenicTrichoderma;Trichodermahamatum; Biological characteristics

1001-4829(2016)09-2216-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.035

2015-10-12

辽宁省教育厅科学研究一般项目 (L2012472)；丹东市科学技术计划项目(农业公关及产业化)(201402)

李 娟(1980-)，女，辽宁朝阳人，博士，讲师，主要从事食用菌栽培及病害防治，E-mail: smilejuanzili@sina.com。

S646.9

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