镉对体外培养小鼠皮肤细胞存活的影响

王 晶, 商 旋, 张晓敬, 常世民,2, 马 爽

(1.廊坊师范学院生命科学学院，河北 廊坊 065000；2.河北省高校食药用菌应用技术研发中心，河北 廊坊 065000；3.廊坊市食用菌技术重点实验室，河北 廊坊 065000)

镉对体外培养小鼠皮肤细胞存活的影响

王 晶1,2,3, 商 旋1, 张晓敬1, 常世民1,2, 马 爽1

(1.廊坊师范学院生命科学学院，河北 廊坊 065000；2.河北省高校食药用菌应用技术研发中心，河北 廊坊 065000；3.廊坊市食用菌技术重点实验室，河北 廊坊 065000)

研究不同浓度的氯化镉对体外培养的小鼠皮肤细胞存活影响。采用组织块法启动小鼠皮肤细胞的原代培养，胰酶消化法传代培养，利用光镜观察、MTT细胞毒性分析、荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等方法研究镉对小鼠皮肤细胞的毒性作用。结果显示，在37 ℃，含20 %胎牛血清的DMEM/F12培养条件下，小鼠皮肤组织原代启动第2天即有细胞迁出，为成纤维样细胞形态，生长分裂旺盛，第6天即可长成汇合的细胞单层，并能稳定连续传代。20～160 μmol/L氯化镉可显著降低体外培养的小鼠皮肤细胞的存活率，具有浓度和时间的依赖性。处理24和48 h对肝细胞的半致死率浓度分别为39.81和22.39 μmol/L。CdCl2处理导致皮肤细胞染色质的凝缩和片段化，诱导细胞凋亡。

镉；皮肤细胞；细胞培养；细胞凋亡

镉是环境中常见的金属污染物，存在于大气、饮水、食品中。近年来，这种污染物频频出现在各种报纸及文献资料中，如，湖南和广州的大米镉超标事件[1～2]、资生堂化妆品的镉超标事件[3]等。镉中毒可导致神经系统[4]、泌尿系统[5]、呼吸系统[6]和生殖系统[7]功能障碍。而目前国内对镉的细胞毒性研究主要集中于神经细胞[4]、肝细胞[8]、肾细胞[5]和肺细胞[9]等方向，尚未见有镉对皮肤细胞的毒性作用及相关机制的研究报道。本实验以体外培养的小鼠胚胎皮肤细胞为实验对象，研究镉对皮肤细胞的存活及凋亡的影响，从而推测含镉的皮肤接触性物品对皮肤细胞的影响作用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

材料与试剂。BALB/C小鼠6～8周龄，体重18～22 g，购自中国医学科学院实验动物研究所；胎牛血清(FBS) 和氯化镉，上海生物工程有限公司；DMEM/F12培养基 美国Gibco公司；胰蛋白酶和四甲基偶氮唑蓝(MTT)，美国Amresco公司；细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒和Hoechst 33342染色液，上海碧云天生物技术有限公司；实验中所用其他试剂均为分析纯。

仪器与设备。ZHJH-C超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司；BX50系统显微镜和CKX41SF倒置显微镜(配有CCD成像系统)，日本Olympus公司；MCO-20AIC二氧化碳培养箱和MLS-3750高压蒸汽灭菌锅，日本SONYA公司；MJ-160B型恒温水浴锅，上海跃进医疗器械厂；iMark酶标仪酶标仪，美国Bio-Rad公司；Milli-Q超纯水机，美国Millipore公司。VCX130超声波细胞破碎仪，美国Sonics公司；细胞培养瓶、细胞培养板，美国Corning公司。

培养基。小鼠皮肤细胞培养液DMEM/F12 (g/L)： 15.6 g、NaHCO31.2、青霉素0.06(100 U/mL)、链霉素0.1(100 U/mL)，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 小鼠皮肤细胞体外培养的原代启动和传代培养 雌鼠受孕。将处于发情期的雌鼠和雄鼠同笼，检栓后，记为0 d。

组织块法启动原代培养。取怀孕15 d的雌鼠，颈部脱臼处死，75 %乙醇浸泡处理2次，超净工作台中无菌取出子宫，取出胚胎，磷酸缓冲溶液(PBS)漂洗3次，DMEM/F12完全培养液(5 % FBS)漂洗1次，取胚胎背部皮肤，剪成1 mm3大小的组织碎块，离心，弃上清，沉淀用DMEM/F12完全培养液(5 % FBS)悬浮后均匀接种于25 cm2培养瓶底部，翻转倒置，37 ℃培养箱中培养6 h后，补加DMEM/F12完全培养液(20 % FBS)至5 mL/瓶，置37 ℃、5 %CO2培养箱中启动原代培养。

胰蛋白酶消化法进行分离培养(传代)。小鼠皮肤细胞汇合率达80 %～90 %后，吸弃旧培养液，PBS漂洗，2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化处理1～2 min，吹下贴壁细胞，用含20 % FBS 的DMEM/F12完全培养液重悬并接种至2个细胞培养瓶中，置5 % CO2、37 ℃培养箱中静置培养。

1.2.2 小鼠皮肤细胞的生长曲线制作 按上述传代方法制备细胞悬液，台盼蓝染色，统计活细胞数量，含15 % FBS的DMEM/F12完全培养液调整细胞密度为1×105个/L，均匀接种至24孔细胞培养板中，每孔1 mL，37 ℃，5 % CO2培养箱中静置培养。每12 h取3个孔的细胞分别进行细胞计数，取平均值。以时间为横坐标、细胞平均密度为纵坐标绘制出生长曲线。

1.2.3 细胞接种和氯化镉处理 取10代前的对数生长期的小鼠皮肤细胞，胰蛋白酶消化，台盼蓝染色，统计活细胞数量，DMEM/F12完全培养液(20 % FBS)调整细胞密度为5×104个/mL，接种至96孔细胞培养板中，每孔180 μl，37 ℃，5 % CO2培养箱中静置培养24 h后，添加终浓度分别为0、5、10、20、40、80和160 μmoL/mL的氯化镉(CdCl2)，37 ℃，5 % CO2培养箱中继续培养。

1.2.4 MTT法测定细胞存活率 不同浓度CdCl2处理24和48 h 后，添加5 mg/mL MTT溶液，每孔20 μl，37 ℃，5 % CO2培养箱中培养4 h 后，弃上层液体，PBS漂洗2次，添加DMSO，每孔150 μl，低速震荡15 min，酶标仪测定490 nm光吸收值A490，每个浓度设10个重复，按照公式“抑制率=(1-实验组平均OD 值/对照组平均OD 值)×100 %”计算CdCl2对细胞的抑制率, 用Logit 法计算半致死浓度(IC50)。

1.2.5 Hoechst 33342染色 制备细胞悬液并接种至洁净且无菌的盖玻片上，每个盖玻片上的细胞数为1000～2000个，37 ℃、5 %CO2培养箱中培养24 h后，添加不同浓度CdCl2处理一定时间后，吸弃旧培养液，PBS漂洗3次，4 %多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗3次，滴加Hoechst33342染液，避光染色25～30 min，PBS漂洗3次，将盖玻片置于干净载玻片上，荧光显微镜观察，拍照。

1.2.6 DNA琼脂糖凝胶电泳 按上述传代方法接种细胞，添加终浓度为40 μmol/L的CdCl2，相同培养条件培养一定时间后，细胞刮刀收集细胞，离心，去上层液体，200 μl PBS重悬细胞后，加入4 μl RNaseA，混匀，室温放置3～5 min，添加20 μl蛋白酶K，混匀，70 ℃孵育10 min后，添加200 μl样品裂解液B，混匀后加入到DNA纯化柱内，≥6000 g离心1 min，倒弃废液收集管内液体。加入500 μl洗涤液I，≥6000 g离心1 min，倒弃废液收集管内液体。加入600 μl洗涤液II，≥18 000 r/min离心1 min，倒弃废液收集管内液体，再≥18 000 r/min离心1 min，以去除残留的乙醇。将DNA纯化柱置于1.5 mL离心管中，加入50～100 μl洗脱液。室温放置3 min。≥12 000 r/m离心1 min后得纯化的总DNA。取总DNA进行1 %琼脂糖凝胶电泳，上样量为5～10 μl，50 v电泳4～6 h(电泳缓冲溶液1×TAE)，EB染色，凝胶成像系统观察、拍照。

A.原代培养启动第2天; B.原代培养启动第3天; C.原代培养细胞长成单层; D.第1代细胞A. 2 days after primary culture ; B. 3 days after primary culture; C. Primary cultured murine skin cells monolayer; D. Murine skin cells at passage 1图1 原代培养和传代培养的小鼠皮肤细胞(200×)Fig.1 Primary cultured and subcultured murine skin cells

图2 第8天小鼠皮肤细胞生长曲线Fig.2 The growth curve of murine skin cells at the eighth days

1.2.7 数据处理 实验结果用平均数±标准差表示，软件SPSS 20.0分析处理数据，方差分析采用单因素ANOVA，P<0.05，表示差异显著，P<0.01，表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠皮肤细胞的原代培养与传代培养

小鼠皮肤细胞原代启动后第2天，组织块边缘开始有细胞迁出，迁出细胞多数呈成纤维细胞样形态(图2A)，细胞生长分裂旺盛。随着培养时间的延长，细胞在组织块周围形成较大生长晕(图1B)。说明原代培养条件适合皮肤细胞的迁出和增殖。

原代培养启动第6天，皮肤细胞即可相互汇合成单层(图1C)。胰蛋白酶消化法传代后，细胞仍为成纤维细胞样形态，细胞透光性较好，细胞增殖速度较快，第5～7天可再次长满单层，说明胰酶消化法比较适宜于体外培养的小鼠皮肤细胞。

2.2 小鼠皮肤细胞生长曲线

每12 h收集培养板中的小鼠皮肤成细胞，台盼蓝染色后血细胞计数板统计活细胞数量，以时间为横坐标，细胞浓度为纵坐标，绘制细胞生长曲线(图2)，从图2可以看出，小鼠皮肤细胞在接种后0～24 h处于迟缓期，36～60 h处于对数期，而到达60～72 h后处于平台期，72 h后处于衰退期，因此收集培养36～60 h的细胞进行再接种和CdCl2处理实验。

2.3 镉对小鼠皮肤细胞形态的影响

不同浓度CdCl2处理小鼠皮肤细胞24 h后，与对照组(图3A)相比，5～20 μmol/L CdCl2处理组细胞的形态与贴壁能力没有太大的变化(图3B～D)，40 μmol/L CdCl2处理组细胞皱缩变圆或者脱离细胞培养瓶底部(图3E)；80～160 μmol/L CdCl2处理组细胞绝大部分已变圆脱落(图3F和G)。

A～G：氯化镉添加浓度分别为0、5、10、20、40、80、160 μmol/L A-G: Treated group by CdCl2: 0,5,10,20,40,80,160 μmol/L 图3 不同浓度氯化镉处理24 h的小鼠皮肤细胞(200×)Fig.3 Murine skin cells treated with CdCl2 for 24 hours

A～G: 氯化镉添加浓度分别为0、5、10、20、40、80、160 μmol/LA-G: Treated group by CdCl2: 0,5,10,20,40,80,160 μmol/L 图4 不同浓度氯化镉处理48 h的小鼠皮肤细胞(200×) Fig.4 Murine skin cells treated with CdCl2 for 48 hours

不同浓度CdCl2处理小鼠皮肤细胞48 h后，与空白对照组(图4A)相比，5～10 μmol/L CdCl2处理组少量细胞皱缩变圆(图4B和C)；20～160 μmol/L CdCl2处理均可不同程度引起小鼠皮肤细胞变圆脱落，随着添加浓度的增加，变圆脱落的细胞数量逐渐增加(图4D～G)。

2.4 镉对小鼠皮肤细胞存活的影响

MTT实验结果显示，与空白对照组相比，20～160 μmol/L的CdCl2处理皮肤细胞24和48 h均可显著的降低小鼠肝细胞的存活率(P<0.05)，且随着添加浓度的增加，细胞存活率逐渐降低(图5)。经寇氏法计算得，CdCl2处理24和48 h对肝细胞的半致死率浓度分别为39.81和22.39 μmol/L。

细胞凋亡起始以后，细胞会经历一系列的形态学变化，如细胞核染色质凝缩等[10]。Hoechst33342是一种可以穿透细胞膜的常用于细胞凋亡检测的荧光染料，进入细胞核后与双链DNA结合，在紫外光激发下，Hoechst-DNA发出蓝色荧光(图6A)，凋亡细胞因染色质凝缩，会呈现致密浓染(图6B)。

图5 MTT法检测细胞存活率Fig.5 Murine skin cells’ viability determined by MTT assay

A.对照组; B.40μmol/L的CdCl2处理48h, A.control; B.treated group by 40μmol/L CdCl2 for 48h,“↙”示正常细胞核；“*”示致密浓染的凋亡细胞细胞核;‘↙’ control;‘ *’ apoptotic cell nucleus 图6 Hoechst33342染色后小鼠皮肤细胞细胞核(400×)Fig.6 Murine skin cells’ nucleus stained by Hoechst33342

图7 DNA 琼脂糖电泳Fig.7 DNA agarose gel electrophoresis

细胞凋亡晚期，内源性核酸酶被激活，基因组DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带(DNA ladder)[10]。琼脂糖凝胶电泳结果显示，与阴性对照相比，CdCl2处理小鼠皮肤细胞48 h后，基因组DNA出现梯状条带；处理72和96 h后，小鼠皮肤细胞基因组DNA出现明显的梯状条带，且200、400、600、800 bp的DNA条带清晰可见(图7)，说明CdCl2处理导致小鼠皮肤细胞的凋亡。

3 讨论与结论

镉(Cd)是一种生物体非必须的元素，具有潜在毒性，因其在工业上应用广泛，已逐渐成为环境中主要的污染物之一[11]。镉在土壤和植物中有蓄积作用，并不可逆的通过胃肠，肺和皮肤吸收后积累于人体组织和器官中(特别是肾脏[5]和肝脏[12])，其在人体中的半衰期长达15 至20年，并可持续产生毒性作用[13]。

本文利用组织块法启动了皮肤细胞的体外培养，并利用传代次数少于10次的皮肤细胞培养体系，研究一定量的CdCl2对其存活的影响作用。结果表明，一定浓度(20～160 μmoL/mL)CdCl2处理皮肤细胞一定时间均可引起细胞染色质凝缩和DNA的损伤进而诱导皮肤细胞的凋亡。CdCl2处理24和48 h对肝细胞的半致死率浓度分别为39.81和22.39 μmol/L。相关认为，镉诱导的细胞凋亡信号通路主要为3 条：①内质网应激(ER stress)介导的，通过未折叠蛋白应激反应(UPR)途径[14-15]和calpain-caspase途径[16-17]；②线粒体介导的，caspase 依赖性[18]和非caspase依赖性途径[19]；③P53 依赖性途径。而CdCl2通过上面哪种或者哪几种信号转导通路诱导皮肤细胞的凋亡有待进一步研究。

[1]高 志, 崔海涛, 张高科, 等. 什么污染了我们的大米?——关于湖南攸县 “镉大米” 的调查[J].中国农资, 2013 (22): 5-7.

[2]周少君, 邓小玲, 梁 辉, 等. 2012 年广东省市售大米镉含量调查及初步膳食暴露评估[J]. 华南预防医学, 2013, 39(6): 4-9.

[3]赵 雪.资生堂被查出镉超标[N].中国企业报,2013-03-12(017).

[4]朱俊德, 余资江, 戈 果, 等. 慢性镉中毒对小鼠学习记忆及海马 CA3 区的影响[J]. 环境与健康杂志, 2009 (7): 576-579.

[5]李颖超, 武 昕, 严家荣, 等. 亚慢性镉中毒肾功能性损伤小鼠模型的研究[J]. 山西医科大学学报, 2013, 44(4): 267-270.

[6]张巧耘, 邹 芳. 急性镉中毒并发中毒性肺水肿的临床护理[J]. 上海护理, 2011, 11(5): 46-47.

[7]周 雍, 郑 尊. 急性镉中毒大鼠睾丸氧化损伤机制的研究[J]. 第二军医大学学报, 2002, 23(1): 64-66.

[8]陈 强, 肖银霞, 王立成, 等. 镉对鸡肝脏抗氧化系统功能以及中药四君子汤拮抗效应的影响研究[J]. 中国农学通报, 2012, 28(23): 66-68.

[9]常云峰. 镉致肺纤维化作用机制的初步研究[D]. 长沙: 中南大学, 2013.

[10]翟中和,王喜忠,丁明孝. 细胞生物学[M]. 第四版. 北京:高等教育出版社, 342-343.

[11] 陈桂芬，雷 静，黄雁飞，等.广西稻田镉污染状况及硅对稻米镉的消减作用[J].南方农业学报,2015,46(5):772- 776.

[12]Eum K D, Lee M S, Paek D.Cadmium in blood and hypertension[J]. Sci Total Environ, 2008, 407(1): 147-253.

[13]蒋廷亚, 周 阳, 林 毅, 等. 镉代谢分子机制研究进展[J]. 安徽农业大学学报, 2013, 40(4): 678-684.

[14]Yokouchi M, Hiramatsu N, Hayakawa K, et al. Atypical, bidirectional regulation of cadmium-induced apoptosis via distinct signaling of unfolded protein response[J]. Cell Death & Differentiation, 2007, 14(8): 1467-1474.

[15]Yokouchi M, Hiramatsu N, Hayakawa K, et al. Involvement of selective reactive oxygen species upstream of proapoptotic branches of unfolded protein response[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(7): 4252-4260.

[16]Thévenod F. Cadmium and cellular signaling cascades: to be or not to be [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2009, 238(3): 221-239.

[17]Yeh J H, Huang C C, Yeh M Y, et al. Cadmium-induced Cytosolic Ca2+Elevation and Subsequent Apoptosis in Renal Tubular Cells[J]. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 2009, 104(5): 345-351.

[18]Liu Y, Templeton D M. Initiation of caspase-independent death in mouse mesangial cells by Cd2+: Involvement of p38 kinase and CaMK-II [J]. Journal of Cellular Physiology, 2008, 217(2): 307-318.

[19]Lee W K, Abouhamed M,and Thevenod F. Caspase-dependent and-independent pathways for cadmium-induced apoptosis in cultured kidney proximal tubule cells[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2006, 291(4):F823-832.

(责任编辑 李 洁)

Effect of Cadmium on Survival of Cultured Murine Skin Cellsinvitro

WANG Jing1,2,3, SHANG Xuan1, ZHANG Xiao-jing1, CHANG Shi-min1,2, MA Shuang1

(1.College of Life Sciences, Langfang Teachers University, Hebei Langfang 065000, China;2.Edible and Medicinal Fungi Research and Development Center of Hebei Universities, Hebei Langfang 065000, China;3.Edible Fungi Key Laboratory of Langfang City, Hebei Langfang 065000, China)

To investigate the effect of cadmium on survival of cultured murine skin cellsinvitro, primary murine skin cells were cultured with tissue block method and subcultured by trypsin digestion. Toxic effect of cadmium on cultured murine skin cells were examined with microscope, MTT assay, fluorescent staining and DNA agarose gel electrophoresis. The results showed that cells migrated from skin tissue 2 days after the primary culture initiated in Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Ham’s Nutrient F-12(1∶l)(DMEM/F12)medium supplemented with 20 % fetal bovine serum (FBS) DMEM/F12(contained) at 37 ℃. The skin cells in primary culture and subculture were in fibroblast morphology, proliferated to continuous monolayer within 8 days and propagated stably. Cadmium chloride (CdC12) at the concentration of 20～160 μmol/L had obvious inhibitory effects on skin cells survival in dose-and time-dependent manner. The half lethal concentration (IC50) at 24 and 48 h was 39.81 and 22.39 μmol/L, respectively. Treatment of CdC12caused chromatin condensation and fragmentation (DNA ladder). Meanwhile, skin cells initiated apoptosis process.

Cadmium; Skin cell; Cell culture; Cell apoptosis

1001-4829(2016)09-2244-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.041

2015-10-12

河北省生物学实验教学示范中心(031040302)；河北省生物科学专业综合改革试点(031040503)；河北省高等学校科学技术研究青年基金项目(QN2016019)；廊坊师范学院微生物学重点学科项目(201501)；廊坊师范学院教育教学改革项目(2013022)；廊坊师范学院大学生创新创业训练计划(201310100022)；廊坊师范学院生命科学学院本科生参与研究项目(SKCYZ201303)

王 晶(1983-)，女，山东东平，博士，讲师，研究方向为细胞毒理学和细胞免疫学，E-mail: oucflora@163.com。

R114

A