环境中抗生素污染现状及检测技术

周志洪 吴清柱 王秀娟 丘锦荣

(1. 广州市环境监测中心站，广州 510030;2. 环境保护部华南环境科学研究所， 广州 510655)



综 述

环境中抗生素污染现状及检测技术

周志洪1吴清柱1王秀娟2丘锦荣2

(1. 广州市环境监测中心站，广州 510030;2. 环境保护部华南环境科学研究所， 广州 510655)

抗生素的滥用所造成的水环境污染近年引起了关注，目前国内发达城市对抗生素的研究越来越热。本文对水环境中抗生素的种类、污染现状及检测技术等国内外研究进展作了综合分析和讨论。

水环境 抗生素 检测技术

1 引 言

自1929年Fleming发现青霉素并由Florey和Chain用于临床以来，已有百余种抗生素被广泛使用，主要用于治疗人类感染性疾病、畜牧业和水产养殖业防治感染性疾病以及用作促长剂(AGP)加快动物的生长，有效地保障了人类的健康和财产。但是，20世纪70年代以来，抗生素的滥用所导致的细菌耐药性已成为威胁人类健康的焦点问题，而抗生素及其衍生物作为微量污染物对水所造成的污染(通常在ng/L到mg/L水平)及由此产生的环境效应在近年也开始被关注。虽然抗生素及其衍生物是微量污染物，但是长期大量输入环境会造成细菌耐药性的不断增强和环境雌性化等问题[1]。

2 抗生素的种类

抗生素的概念是不断扩大的，最初只包括对微生物的作用，现在已经有抗真菌、抗病毒、抗寄生虫以及杀虫、除草的抗生素或抗菌素，近年来把来源于微生物的酶抑制剂也包括在抗生素中，总数己超过9000种。目前主要的抗生素类型包括：

(1)β-内酰胺类：β-内酰胺类抗生素是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，是抗生素中使用量最大的一类，但呈下降趋势，主要包括青霉素、头孢菌素和最近发现的一系列抗生素如头孢哌酮、米罗培南等。

(2)喹诺酮类：是完全由化学家合成出来的一类抗生素，主要包括环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、氟甲喹、托氟沙星和依诺沙星等。喹诺酮类药物已经在我国人医和兽医临床上被广泛应用，被认为是理想的抗菌药物。

(3)大环内酯类：临床常用的有红霉素、罗红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素和交沙霉素等，该类药属静止期抑菌剂。

(4)磺胺类药物：临床常用的有磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺甲氧嘧啶等。磺胺类药物是应用最早的一类人工合成抗菌药物，主要包括磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嗪等。

(5)四环素类：主要包括四环素、土霉素(氧四环素)、金霉素(氯四环素)和去甲金霉素等。

3 抗生素污染现状

3.1 水环境中的抗生素残留

用于人类疾病防治、家禽和水产养殖病害预防及饲料添加剂的抗生素，一部分在生物体内吸收或者转化，并以代谢物的形式排出体外。同时，还有很大一部分将以原型药物的形式排出体外并直接进入水环境。此外，用于水产养殖以及药物生产过程中大量残留的抗生素原型药物也直接进入环境中。有研究表明，抗生素摄入后除少部分残留在体内，85%以上以原药和代谢产物的形式经由病人与动物的粪尿排出体外，进入生态环境，对农田土壤、地表水和地下水及生态系统中各类生物产生危害，并诱发和传播各类抗生素耐药细菌[2]。目前，在环境水体中，包括河流、地下水、甚至饮用水中已经检测到50多种抗生素。国外许多学者，特别是欧洲及美国的科学家对此进行了一系列的研究。美国国家调查局1999～2000年的调查结果，在所调查的30个洲139条河流中，多种抗生素浓度较高[3]，具体见表1。

注：表中同一化合物重复出现两次，原文是用不同方法分析得出的数据。

研究表明有代表性的抗生素在德国某污水处理厂的出水口和地表水中均能检测到[4,5]，分析大环内酯素、磺胺类、青霉素类和四环素类等18种抗生素的浓度，在河水中检测到浓度为0.62 μg/L的红霉素，0.19 μg/L的罗红霉素和克拉霉素等，而四环素类和青霉素类的浓度相对较低，分别为50和20 ng/L左右。主要包括磺胺类、大环内酯类、四环素类、喹诺酮类和甲氧苄氨嘧啶等，浓度在ng/L～μg/L之间。目前世界各国的污水处理厂进出水中都能检测到抗生素，检出的抗生素种类和浓度与各地区抗生素使用情况密切相关。世界各国检出频率较高的抗生素为磺胺类和喹诺酮类抗生素，与这两类抗生素在治疗疾病、畜牧养殖方面应用较广相符[6]。表2表明，世界各国污水处理厂出水中抗生素的种类与浓度有较大差异。我国是抗生素生产大国，也是抗生素使用大国，据不完全统计，我国目前使用和销售量列在前15 位的药品中有10 种是抗菌类药物，所以我国城市污水中残留的各类抗生素远高于其他国家，尤其是磺胺类抗生素。我国城市污水中5 种磺胺类抗生素的最大浓度均在1500 ng/L 以上，而韩国、西班牙、加拿大和澳大利亚等国家污水处理厂出水中磺胺类抗生素最大浓度基本低于500 ng/L。美国环丙沙星和甲氧苄啶的检出浓度较高，环丙沙星在污水处理厂出水中最高浓度接近1000 ng/L，甲氧苄啶最高浓度达到1220 ng/L。β-内酰胺类抗生素稳定性较差，在水环境中容易降解成其他物质，因此，尽管使用十分广泛，污水中被检出次数较少。

表2 各国污水处理厂出水中抗生素检出浓度 ng/L

注：nd 为未检出，LOQ 为定量限。

国内抗生素污染的研究主要集中在珠江三角洲和长江三角洲及邻近水系，这些地区人口密度高、发展速度快，抗生素的使用更加广泛。表3列举了国内几个地方水体中抗生素的含量[7-9]。在深圳河中抗生素的浓度达0.018～1.195μg/L，珠江广州段含量为0.07～0.489μg/L，这些抗生素包括氧氟沙星、诺氟沙星、罗红霉素、红霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、阿莫西林、氯霉素[9]，在珠江口典型水产养殖区水体中诺氟沙星的检出浓度为29.79～78.29 ng/L[10]。同济大学对城市生活污水、畜禽养殖场和水产养殖场排放的废水进行抗生素的分析[11]，结果表明，在3种典型废水中，养猪场废水检出抗生素的种类最多，浓度也最高，磺胺类在3种废水中检出频率最高，尤其是磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲氧嘧啶。养猪场废水中检出磺胺甲噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺氯哒嗪5种磺胺类抗生素(<5μg/L)，四环素类的四环素、土霉素和强力霉素(30.05～100.75μg/L)。在海口市地表水系中6种抗生素皆有检出，检出浓度在3.4～1385.8 ng/L之间，其中，磺胺甲噁唑、环丙沙星和氧氟沙星在水系每个检测断面中均有检出，磺胺甲噁唑的检出浓度最大，且含量明显高于欧美以及香港维多利亚港和珠江广州河段的抗生素药物残留量[7]。

表3 国内地表水体中抗生素含量 ng/L

注：nd表示未检出。

3.2 土壤中的抗生素残留

抗生素使用后通常大部分以药物原形随粪尿排出，研究显示在尿液肥料中，细菌能降解家禽排泄的药物代谢物，使代谢物重新转化为活性物质。而抗生素在污水处理厂的去除率并不高[12]，导致大量抗生素进入地表水，造成河流抗生素污染，并可能通过灌溉水进入农业土壤。

另外，动物用抗生素造成猪粪、鸡粪等禽畜废物中抗生素的含量普遍较高，通过有机肥施用会造成土壤污染。对广州市代表性养殖场畜禽废物、施用畜禽粪土壤和鱼塘水中测定尼卡巴嗪、喹乙醇、四环素类、磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类等抗生素的含量。结果发现猪粪、鸡粪中抗生素含量最高的均为四环素类，分别为123.76 mg/kg、14.59 mg/kg；含量最低的均为氯霉素类，分别为2.35 μg/kg、0.08 mg/kg。施用禽畜粪土壤中四环素类、喹诺酮类含量较高，分别为70.40 μg/kg、49.77 μg/kg[13，14]。

有研究对广州、深圳等地菜地土壤中3种四环素类和6种磺胺类抗生素的污染进行分析。四环素类单个化合物检出率为19.35%～96.77%，平均含量为9.6～44.1 μg/kg，以四环素为主；磺胺类单个化合物检出率为25.81%～93.50%，平均含量为4.9～51.4 μg/kg，以磺胺甲噁唑、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶为主[15]。调查山东省某典型设施菜地的20个蔬菜大棚土壤中14种抗生素的含量，结果表明，在所有的土样中均检测出抗生素，其中4种四环素类抗生素(如四环素、土霉素、金霉素和强力霉素)是该地区主要的抗生素种类，单个化合物的检出率均为100%，其含量范围分别在2.11～139.16 μg/kg、6.06～332.02 μg/kg、1.82～391.31 μg/kg、2.20～248.56 μg/kg之间。磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素也均有检出，检出率为85%。而且该设施菜地种植不同蔬菜的土壤中抗生素种类和含量差异很大，个别大棚土壤诺氟沙星(QNC)和氧氟沙星(OFC)含量分别高达373.73 μg/kg和643.34 μg/kg，均远远地超过抗生素生态毒害效应触发值(100 μg/kg)[16]。

3.3 污泥和沉积物中的抗生素残留

抗生素进入水体后，大部分将吸附到沉积物中。鱼饲料中的药物直接进入水环境中，大部分的饲料不是被鱼消耗，而是穿过网箱，积聚在渔场底部沉积物中[17]。有人估计，在水产养殖中投放到水中未被食用及食用后又随排泄物进入水体中的抗生素至少有75%会进入水体并在底泥中形成蓄积性污染[18]。这部分抗生素主要有磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、氯霉素、甲砜氯霉素、氟甲喹、氟苯尼考和制霉菌素等。某些调查也显示了鱼塘沉积物中兽药抗生素的存在[19]。在珠江口典型水产养殖区沉积物中抗生素含量最高的是诺氟沙星，检出浓度为50.24～153.06 ng/g。沉积物中抗生素检出率和种类均比水中的高，表明沉积物既是抗生素的储存库又是水中抗生素潜在的污染源。相同养殖模式下，养殖时间越长，抗生素的总量越高，显示出抗生素的累积效应[10]。

4 抗生素检测技术

4.1 样品预处理

环境样品中的抗生素都是微量存在的，成分复杂，目前的检测技术都难以直接检测，对样品进行有效的预处理，选择灵敏度高的检测技术，是环境样品中抗生素检测的必要步骤。预处理的目的是浓缩样品中的分析物，去除基质的干扰并为随后的色谱分析营造合适的进样条件。

4.1.1 固相萃取(SPE)技术

含水的样品，如牛奶等以及水样的预处理最常见的是固相萃取法，常用的有HLB，C18等吸附剂，吸附后使用甲醇或者乙腈作为解吸的溶剂，如果得到的解吸液较为干净则可以直接用仪器进行分析，如果还需进一步净化，则萃取液重新溶于一定量的纯水中，重复固相萃取的步骤。

固相萃取法具有耗费有机溶剂少、快速高效、易于实现自动化等优点，而且萃取材料种类丰富，这使得固相萃取成为目前应用最广的环境样品富集分离纯化技术。用固相萃取测定蜂胶中的四环素类抗生素残留时，使用SPE对样品进行前处理，对比了几种固相萃取法对蜂胶样品中四环素类抗生素的萃取效果，研究表明，其对四环素的萃取回收率Oasis HLB柱>超声波萃取>HLB+羧酸>C18萃取柱>C18+羧酸>机械振摇萃取[20]。使用矩阵式固相分散萃取对牛奶中的四环素类物质进行富集分离分析，对比了弗洛里硅土柱、硅胶柱和C18萃取柱对四环素、土霉素和多西环素的萃取性能，萃取分离效果C18>硅胶柱>弗洛里硅土柱[21]。采用XAD-2柱作为萃取柱，对食物中的四环素类进行富集分离，萃取回收率为90.6%～93.1%[22]。

固相微萃取技术是一种集采样、萃取、浓缩、进样为一体的新颖样品前处理技术。利用分散固相微萃取与高效液相色谱联用技术对水体和牛奶中的四环素、土霉素、氯霉素和多西环素进行检测，研究发现其萃取回收率为97.1%～104.1%[23]，这种SPME-HPLC联用技术对水体和牛奶中几种抗生素的检测限分别为0.7～3.5 ng/L、7.9～35.3 ng/g。为了提高固相微萃取的选择性，使用四环素作为模板，制备了一种新型分子印迹固相微萃取(MIP-SPME)纤维，基于这种新型纤维的MIP-SPME-HPLC联用技术对几种四环素类抗生素的检测限为1.0～2.3 μg/L[24]，与常规非分子印迹固相微萃取相比，MIP-SPME对四环素及其结构类似物表现出了极强的选择性。但是，目前市场化的SPME纤维很少，这成为限制SPME广泛使用的因素。而且，SPME的代价比较高，微萃取纤维易碎，使用寿命短，这就使得固相微萃取纤维的开发和推广成为该技术应用的首要问题。

近年来，随着磁性吸附材料的研发和完善，由于其具有易于分离以及高效快速的吸附脱附性能，一些研究者开始尝试将其应用于固相萃取。将磁性硅基材料应用于牛奶中四环素的检测，与常规固相萃取对比，两种方法对牛奶中四环素类物质的检测准确度相当，且磁性固相萃取对四环素类物质的回收率达91%～97%[25]。磁性固相萃取的出现，改变了常规固相萃取必须将萃取材料填充成柱的模式，解决了样品体积很大时常规固相萃取耗时较长的问题。磁性固相萃取必将成为样品前处理的一个重要发展方向。

4.1.2 土壤等固体样品的萃取

对于复杂基质的环境固体样品的预处理，大多是基于固液萃取的。常用的用萃取剂有：甲醇、Na2EDTA-甲醇-水溶液、乙酸乙酯-甲醇-水溶液、乙腈、乙腈-三氯乙酸溶液、盐酸-甲醇(1∶50)、EDTA-McIlvaine缓冲液等。提取后通过减压蒸馏或者氮吹把有机溶剂去掉，剩下的提取液以水为主，则加入一定量的纯水，再经过与水样同样的处理步骤(即固相萃取)。

使用磁性固相萃取能简化固体样品的萃取，利用氧化铝包裹四氧化三铁(Fe3O4/Al2O3NPs)，作为磁性固相萃取材料，应用于土壤中磺胺类抗生素的检测分析，研究表明Fe3O4/Al2O3材料对磺胺嘧啶等6种磺胺类抗生素的富集回收率达71%～93%[26]。也有研究人员制备了一种新型磁性萃取材料，对鸡肉和鸡蛋中几种四环素类抗生素的富集分离实验表明，其对四环素、土霉素等的萃取回收率为72.8%～96.5%[27]。

4.2 抗生素的检测方法

4.2.1 微生物法

微生物检测法是根据抗菌药物对敏感的微生物有指示作用，将提取液和标准溶液对照，从而对抗生素进行定量。该法费用低，但是所用时间较长，并且敏感性差，易受其他抗生素干扰[28]，因此在定性定量上都存在困难，不能满足测定的要求。

4.2.2 酶联免疫吸附法(ELISA)

该方法是基于将待测组分与抗体结合的一种检测技术，其具有操作简便、样品无需纯化浓缩能分析大量样本等优点，但抗体制备不易，监测时间长，通常需要2～4小时，假阳性出现概率大。

4.2.3 气相色谱法

气相色谱法具有高的选择性和灵敏性，然而大多数抗生素类药物具有非挥发或热不稳定的特点，气相色谱检测常需要衍生化，这不仅延长了检测时间，而且可能带来分析误差，这使其在抗生素检测方面的应用受到一定的局限。有研究使用气相色谱检测10种样品(包括海产品、肉、蜂蜜等)中的氯霉素，使用气相色谱-电子捕获(GC-ECD)、气相色谱/质谱-电子电离模式-选择离子(GC/MS-EI-SIM)和气相色谱/质谱-负化学离子化模式-选择离子(GC/MS-NCI-SIM) 3种检测方法，它们的检测限分别达到1.0μg/kg、1.0μg/kg、0.1μg/kg，低于液相色谱-紫外检测法的检测限(10μg/kg)；3种检测方法中GC/MS-NCI-SIM的信噪比高于GC/MS-EI-SIM，这可能是由于NCI可以减少电离衍生氯霉素的小片段而使灵敏性得到提高，但GC-ECD在低浓度时受基质的影响很大[29]。

4.2.4 液相色谱法

(1)液相色谱/紫外(LC/UV)或液相色谱/荧光检测(LC/FLD)

LC/UV检测是较早用来分离检测抗生素的一种方法，该方法因操作简单、成本低等特点仍然广泛用于抗生素检测分析中。使用LC/UV检测养猪废水中8种磺胺类[30]，磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲氧嗪的LOQ均为7.5 ng/L，磺胺、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺恶喹啉的LOQ均为5.0 ng/L。使用荧光检测器(FLD)对喹诺酮类抗生素定量[31]，该方法对自来水加标的回收率为80%～120%，对地表水样品加标的回收率为63%～106%，方法的定量检测限为0.030～0.080 μg/L，相对标准偏差小于18%。

使用紫外和荧光检测器最大的问题在于基体的干扰，在检测复杂的环境样品时，往往基线会被抬高，干扰峰多，这些都会造成假阳性，并造成定量不准确。

(2)LC/MS或液相色谱串联质谱(LC/MSn)

液相色谱-质谱联用技术始于1970年，液相色谱质谱法可以鉴别和分析痕量水平的物质，并定量微量物质。质谱(MS)尤其是串联质谱(MS/MS)通过碰撞诱导解离(CID)和选择离子模式(SIM)，选择性好，灵敏度高，所得质谱图对每一种物质都具有专一性。电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)是LC-MS通常采用的离子化方式。大气压光电离(APPI)较前两种电离模式不容易产生信号抑制，有利于分析复杂样品的目标物质。与LC/UV和LC/FLD相比，LC/MS因具有高灵敏度和实证能力而越来越多地用于抗生素分析。如采用高效液相色谱-串联质谱法对水环境中微量磺胺、大环内酯类抗生素、甲氧苄胺嘧啶与氯霉素的检测[32]。采用超高压液相色谱-串联质谱同时检测环境水样中四环素类和喹诺酮类抗生素含量[33]。用超高压液相色谱-串联质谱测定水中19种抗生素[34]。LC-MS-MS法是近年来抗生素分析使用最广的一种方法。

由于环境样品中抗生素含量低，这要求方法具有低的检测限。尽管MS因仪器费用高还未能普及，但因其灵敏性高、重复性好等优点已越来越多地用于环境中抗生素残留分析。研究人员还在不断尝试操作简单、成本低、耗时少、准确度和灵敏度高的检测技术。

5 问题与展望

虽然抗生素的使用会带来环境残留的问题，但是抗生素对于人类来说，是利大于弊的。对于这些新型的污染物，世界卫生组织《饮用水水质总则》第四版的相关表述为：“饮用水中存在的药物类化学物质浓度一般比治疗剂量的最小量级还要低。因此，摄入饮用水中个别这类物质不大可能对人类健康产生明显的负面影响。本准则也就未对此类化学物质建立正式的准则值。”政府和媒体应该引导广大群众重视的是抗生素的滥用问题，特别是畜牧业、渔业等养殖业，媒体也不宜过于夸大环境中痕量抗生素的负面作用。

目前，中国对抗生素的调查研究工作仅限于高校或研究所的研究性工作，尚未开展水环境中抗生素污染状况的全国性系统调查工作。由于近两年来媒体对环境抗生素残留的关注，许多发达城市都要面临将抗生素纳入常规性的监测。但几乎所有环境监测系统都没有对环境中抗生素残留进行监测，一是由于多数环境监测站还没有监测能力，二是没有抗生素的监测标准和评价标准。固相萃取效-液相色谱串联质谱法是目前国际认可的水中抗生素的定量检测方法，随着监测技术的推广，中国开展抗生素的系统调查工作指日可待。

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A review on present situation and detection technology of antibiotics pollution in environment.

Zhou Zhihong1, Wu Qingzhu1, Wang Xiujuan2, Qiu Jinrong2

(1.GuangzhouEnvironmentalMonitoringCenter,GuangdongGuangzhou510030，China;2.SouthChinaInstituteofEnvironmentalSciences,theMinistryofEnvironmentProtectionofPRC,Guangzhou510655，China)

The water environment pollution caused by the abuse of antibiotics has attracted more attention in recent years. In this paper, a comprehensive analysis and discussion on the types of antibiotics, pollution status and detection technology of the water environment were made.

environment; antibiotics; detection technology

周志洪，女，1975年出生，高级工程师，E-mail：382391030@qq.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.001

2016-05-12