FOXM1在食管鳞癌中的表达及对其放射敏感性的影响

刘琅嬛罗爱武陈科良谷蒙蒙

肖倍倍2邹士涛3何 超3周俊东3黄 波1

1（南华大学公共卫生学院 衡阳 421001）

2（苏州大学放射医学与防护学院 苏州 215123）

3（南京医科大学附属苏州市立医院 南京 215001）

FOXM1在食管鳞癌中的表达及对其放射敏感性的影响

刘琅嬛1,2罗爱武1陈科良1谷蒙蒙2

肖倍倍2邹士涛3何 超3周俊东3黄 波1

1（南华大学公共卫生学院 衡阳 421001）

2（苏州大学放射医学与防护学院 苏州 215123）

3（南京医科大学附属苏州市立医院 南京 215001）

采用Real-time PCR检测40例食管鳞状细胞癌及相对应癌旁组织中FOXM1(Forkhead box M1) mRNA表达情况；免疫组织化学方法检测94例食管鳞状细胞癌组织中FOXM1蛋白的表达情况，分析其与鳞状细胞癌临床病理之间的关系；采用针对FOXM1的siRNA沉默ECA-109、TE-1细胞中FOXM1基因表达水平，通过免疫荧光染色、克隆形成实验检测 FOXM1对食管鳞状细胞癌放射敏感性的影响。结果表明，FOXM1 mRNA表达水平在食管癌组织中显著高于癌旁组织(p<0.01)，其蛋白表达水平与病人生存期负相关。siRNA能有效干扰ECA-109细胞中的FOXM1表达水平，FOXM1沉默细胞中X-射线诱发的γH2AX焦点显著多于对照细胞，FOXM1沉默细胞电离辐射后克隆形成能力显著低于对照细胞。结果提示，FOXM1在食管鳞癌中的表达增加，其表达水平与病人预后负相关；FOXM1基因沉默可显著增强细胞放射敏感性，因此，FOXM1有可能成为食管鳞癌的治疗靶点。

食管鳞癌，FOXM1不良预后，辐射敏感性，DNA损伤修复

食管鳞癌是世界范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一[1]。目前，临床上主要的治疗手段为手术切除治疗、化学治疗和放射治疗等[1]。据统计，70%以上的食管癌患者都会接受放射治疗，然而单纯放疗5年生存率只有10%~30%，肿瘤局部未控率和复发率达60%~80%[2]。因此，寻找新的反映肿瘤敏感性的分子标志物，并对其机理进行深入研究，对于制定食管鳞癌放射治疗策略具有重要意义，同时可开发放疗增敏的新途径。

FOXM1又称MMP-2或FKHL-16，其基因由10个外显子组成，蛋白中翼型螺旋DNA结合域位于第三个外显子，含有110个氨基酸[3]。FOXM1通过此区域与多种基因的启动子结合、调控下游基因转录，从而在G1/S、G2/M转换和有丝分裂进程中发挥至关重要的作用[4]。另外，FOXM1的靶分子同时参与DNA损伤修复和染色质组装等重要生命过程，因此，FOXM1蛋白表达水平与细胞电离辐射敏感性密切相关[5]。

近年来的研究发现，FOXM1在肺癌、乳腺癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤中高表达[6]。为进一步探讨FOXM1与食管鳞癌的关系，本研究通过Real-time PCR和免疫组织化学方法检测FOXM1蛋白在食管鳞癌中的表达情况并分析其与各临床病理参数和病人预后之间的关系；同时通过 RNA干扰的方法下调食管癌细胞中的 FOXM1的表达，进一步探讨FOXM1对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1组织标本及细胞

人食管鳞癌组织94例及其中癌旁组织标本40例均取自在2008年12月至2009年12月间在南京医科大学附属苏州医院胸外科实施手术的患者，术前均有胃镜病理确诊为“鳞状细胞癌”，所有患者均在肿瘤切除后进行了预防性放射治疗。以上所有患者均签名同意其组织标本被用于科学研究。94例食管鳞癌患者中，年龄小于60岁54例，大于等于60岁40例。男性75例，女性19例，T1期3例、T2期17例、T3期74例，所有标本均保存于苏州市立医院。人食管鳞癌ECA-109、TE-1细胞由苏州市立医院肿瘤实验室保存。

1.1.2主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清购于 HyClone公司；Trizol 购于美国Life Technologies公司反转录试剂盒、Real-time PCR 反应试剂盒均购自 Ta Ka Ra 公司；FOXM1-si RNA 片段、阴性对照均由广州锐博生物科技有限公司合成。兔抗人 FOXM1单克隆抗体购于 Cell Signaling Technology公司；鼠抗人b-actin单克隆抗体购于南通碧云天生物公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG二抗购于南通碧云天生物公司。

1.2方法

1.2.1RT-PCR法检测组织中 FOXM1基因mRNA表达水平

按照 Trizol试剂盒说明，抽提组织标本的总RNA，用 Thermo Gene company limited NANO DROP2000 Spectrophotometer 测RNA浓度。使用软件Primer premier 5.0设计引物序列，并由上海捷瑞生物公司合成。PCR引物序列b-actin正向5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’；反向5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’；FOXM1正向5’-CGCGTCAGTTGGGACTTAAG-3；反向5’-ACTATCGCCAACCTCAATGC-3’采用RT-PCR试剂盒进行反转录及PCR扩增。PCR反应参数：预变性95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s；40循环；融解曲线95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃15 s、60 ℃ 15 s。采用∆Ct法计算目的基因的表达值，以b-actin作为内参基因，其中Ct值为基因反应产物的荧光值达到设定域值时所用的反应循环数。目的基因相对表达量为2Ct(β-actin)−Ct(目的基因)。

1.2.2免疫组织化学染色

取组织标本，石蜡切片常规脱蜡、水化，微波抗原修复，敷一抗二抗，DAB显色，苏木精复染，分化、返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封闭，光镜下观察结果。FOXM1阳性信号主要定位于细胞质中，呈现棕黄色，少量位于细胞核，根据其在细胞质或细胞核的染色程度及染色细胞百分率进行评分：无染色或者阳性率<10%为 0分；>10%的轻度染色或者阳性率 10%~40%的中度染色为1分；>40%的中度染色或者10%~40%强染色为2分；>40%的强染色为3分。采用SPSS 17.0统计软件分析所有统计数据。

1.2.3细胞培养

ECA-109、TE-1 细胞常规培养于含 10% 胎牛血清的DMEM 培养基中，置于 37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内，每 2 d 换液1 次，每 3~4 d传代1 次，取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.4Western blot法

提取总蛋白，将提取的总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，将蛋白移至 PVDF 膜上，以含 5% 脱脂奶粉的 TBST 液封闭 1 h，加入一抗，FOXM1，b-actin 4 ℃ 摇床孵育过夜，加入二抗，室温孵育 1 h，将 PVDF 膜置于增强化学发光试剂中反应 1~3 min，于暗室中用 X胶片曝光，显影、定影，观察结果。

1.2.5FOXM1si-RNA合成及细胞转染

转染前将对数生长期的ECA-109细胞以3×105个/孔的密度接种在6孔板内，使用含 10% 胎牛血清的DMEM完全培养液常规培养，24 h后转染。将细胞分FOXM1siNC组、FOXM1siRNA1组、FOXM1RNA2组、FOXM1siRNA3组等4组。基本操作按照说明书进行，双链 siRNA 靶向 FOXM1基因的目的序列为：FOXM1siRNA1正向 5’GGACCACUUUCCCUACUUU dTdT 3’，反向3’ dTdT CCUGGUGAAAGGGAUGAAA 5’；FOXM1siRNA2正向5’ CGGAAAUGCUUGUGAUUCA dTdT 3’，反向3’ dTdT GCCUUUACGAACACUAAGU 5’；实验组 FOXM1siRNA3 组 正 向 5’CCAGCUGGGAUCAAG AUUA dTdT 3’，反向3’dTdT GGUCGACCCUAGUUCUAAU 5’。24 h 后更换新的完全培养液。转染后于24 h提细胞RNA 进行 RT-PCR，48 h 提取细胞蛋白进行 Western blot。

1.2.6免疫荧光

利用 X射线室温下照射处于对数生长期的FOXM1siNC、FOXM1siRNA2、FOXM1siRNA3共3组ECA-109细胞，剂量为2 Gy。分别于辐照后0、0.5、1、2、8 h共5个时间点收集细胞，用4%的多聚甲醛固定30 min，固定后用PBS轻轻漂洗3次，每次5 min；用1% Triton X-100（PBS稀释）室温处理细胞30 min；用含有1% Triton X-100和10%胎牛血清的PBS封闭液封闭细胞30 min；用上述封闭液稀释FOXM1抗体(1:1000)，4 ℃孵育过夜；PBS轻轻漂洗3次，每次5 min；加荧光二抗室温孵育1 h。PBS轻轻漂洗3次，每次5 min；DAPI避光孵育5 min，对细胞进行核染，PBS轻轻漂洗3次，每次5 min，洗去多余的DAPI；用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.7克隆形成实验

取对数生长期的各组细胞制成单细胞悬液，按不同细胞数接种于6孔板中（0 Gy 200个/孔、2 Gy 800个/孔、4 Gy 2 000个/孔、6 Gy 10 000个/孔、8 Gy 20 000个/孔），每个剂量点设3个平行样本， 37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，接受X线单次剂量照射。每3 d更换一次培养液，培养10~14 d，当培养瓶中出现肉眼可见的克隆时终止培养，甲醇固定20 min后，结晶紫染色20 min，显微镜下计数多于50个细胞的克隆数，计算克隆形成率(Plating efficiency, PE)和不同剂量点的细胞存活分数(Surviving fraction, SF)。

PE=未照射组克隆数/接种细胞数×100%，

SF=照射组克隆数/（接种细胞数×PE）。

2 结果

2.1 FOXM1在人食管鳞状细胞癌组织中的表达

采用Real-time PCR法检测了40例食管鳞癌组织及相应的癌旁组织中FOXM1 mRNA表达水平。由图1可见，食管鳞癌组织中FOXM1mRNA相对表达水平明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义。

2.2 FOXM1在食管鳞癌组织中的表达及与食管鳞癌临床病理参数的关系

采用免疫组织化学方法对 94例食管鳞癌患者组织进行染色，按FOXM1蛋白表达量高低将患者分为 FOXM1蛋白高表达组与低表达组；采用Kaplan-meier法分析食管鳞癌中FOXM1蛋白的表达对患者除瘤术后生存期的影响，结果表明，FOXM1蛋白高表达组患者术后生存期较低表达组更短，差异具有统计学意义(p<0.05)（见图2和图3）。

2.3 siRNA介导的FOXM1基因沉默

设计 3条针对FOXM1基因的 siRNA序列(FOXM1 siRNA1、siRNA2、siRNA 3)，与对照序列(siNC)分别转染至 ECA-109细胞。48 h后，FOXM1siNC采用Real-time PCR法检测不同组中FOXM1 mRNA表达水平，由图4(a)所示，3条不同的针对 FOXM1基因的 siRNA处理细胞后，较FOXM1siNC组分别下降了 72%、83%、84%（图4(a)）。选择其中效果较好的两条序列进一步进行Western blot检测，结果显示，转染siRNA2、siRNA3后ECA-109细胞中FOXM1蛋白表达水平明显降低（图4(b)）。

2.4 免疫荧光检测电离辐射后γH2AX聚焦点动态变化

当DNA损伤发生后，损伤位点附件的组蛋白变体H2AX在139位点发生磷酸化形成γH2AX，因此，γH2AX聚焦点被普遍认为是双链断裂损伤(Double Strand Breaks, DSBs)分子标志物。从图5可以看出，在0 ~ 1 h 之间γH2AX焦点逐渐增加，0.5、1 h时间点γH2AX焦点最多，到2 h γH2AX焦点开始降低，至8 h时，焦点继续降低，DNA损伤逐步恢复。其中，在0.5、1、2、8 h时间点FOXM1siNC组 中 γH2AX 焦 点 比 FOXM1siRNA2、FOXM1siRNA3组少（图6），差异具有统计学意义(p<0.05)。说明在相同的剂量下，在0.5、1、2、8 h时，下调FOXM1基因的食管鳞癌细胞DNA损伤更严重。

2.5 沉默FOXM1基因显著增加食管癌细胞电离辐射敏感性

从图7可以看出，在2、4、6、8 Gy剂量照射的情况下，FOXM1siNC组的细胞存活分数显著高于FOXM1siRNA2、FOXM1siRNA3组，差异具有统计学意义(p<0.05)。说明下调FOXM1的基因表达水平，能显著增加ECA-109细胞电离辐射敏感性，降低其辐照后的存活能力。

3 讨论

FOXM1是FOX转录因子家族成员之一，该转录因子家族已拥有超过50个以上的成员，分别参与调节细胞分化、增殖、代谢、凋亡等多种重要的生理过程。近年来研究发现FOXM1在许多肿瘤细胞中高表达，Yang等[7]通过研究发现，FOXM1在肺鳞癌细胞中高表达；且其表达量跟细胞分化程度以及良恶性程度相关，FOXM1的表达量高的细胞，多低分化、恶性程度高，易转移，预后差；FOXM1在大部分乳腺癌中过表达，且表达量跟乳腺癌的病期呈正相关，随着癌症的发展，FOXM1的表达量不断增高；Yu等[8]发现FOXM1可以通过反式激活PDGF-A (Platelet-derived growth factor-A)从而激活PDGF/AKT信号通路，而该通路已经被证实可以通过在EMT (Epithelial to mesenchymal transition)过程中，阻止肿瘤细胞凋亡从而促进乳腺肿瘤细胞的增殖和转移。其他的实验表明，上调FOXM1表达水平能促进肝癌细胞的转移，增加不良预后[9]。本研究通过对食管鳞癌及癌旁组织检测发现FOXM1mRNA表达水平在食管鳞癌组织中更高，进一步证明了FOXM1在食管鳞癌中高表达。通过免疫组织化学结果得出，食管鳞癌组织中FOXM1蛋白的表达水平与患者术后生存期呈负相关性。

电离辐射可以引起不同形式的 DNA损伤，其中DNA双链断裂损伤是引起细胞死亡的主要原因，细胞对DNA双链断裂损伤修复能力是决定细胞放射敏感性的主要原因之一。有文献报道，FOXM1敲除的小鼠胚胎成纤维细胞 (Mouse embryonic fibroblast, MEFs)中，电离辐射后gH2AX焦点较对照组野生型MEFs高[10]。在骨肉瘤U2OS细胞中，下调FOXM1后，同样能检测到高水平gH2AX焦点。在真核细胞中，DSB的修复机制主要有两种，同源重组途径(Homologous recombination, HR)和非同源末端 连 接途 径 (Non-homologous end joining, NHEJ)[11]。FOXM1在HR中扮演着非常重要的角色。HR DSB修复蛋白BRIP (BRCA1-associated BACH1 helicase)被确认为是FOXM1直接转录的作用靶点，上调BRIP蛋白可以减少细胞的DNA损伤[12]。HR DSB另一重要的修复蛋白RAD51在胶质母细胞瘤中也被认为是FOXM1直接转录的作用靶点[13]。除此之外，FOXM1的作用靶基因 CKS1在下调FOXM1的宫颈癌细胞中的表达量也同时下调[14]，而降低CKS1表达后DNA损坏修复蛋白RAD51降低[15]；在U2OS细胞中沉默FOXM1基因，DNA修复相关基因 XRCC1 (X-ray repair cross-complementing protein)、BRCA2 (Breast cancer associate gene2)蛋白表达量也明显降低[15]；在乳腺癌细胞中沉默FOXM1后，细胞DNA损伤增多，但并未在蛋白和mRNA水平下调XRCC1、BRCA2的表达，表明FOXM1通过调控多种DNA双链断裂损伤修复蛋白参与DNA修复过程，但其具体修复途径还需进一步研究。

我们也通过免疫荧光实验发现在FOXM1下调的食管癌细胞中 γH2AX 焦点明显增加；且通过克隆形成实验也进一步证实了辐照后FOXM1下调后食管鳞癌细胞的增殖能力降低。因此，我们可以猜测FOXM1在食管鳞癌细胞的DNA修复中起到重要作用。因细胞的DNA修复的机制比较复杂，FOXM1在其中发挥作用的机制还有待进一步研究。

FOXM1基因沉默可显著增强食管鳞癌细胞的辐射敏感性。细胞辐射敏感性越强，则放疗效果越好。放疗能对肿瘤进行局部有效控制，有利于控制病灶转移，还可以扩大手术适应症，且中晚期食管鳞癌患者术前放疗可以提高手术切除率及术后生存率[16]。而术后放疗能够杀灭单纯手术治疗残留的肿瘤细胞，以达到控制肿瘤转移和复发的目的，最终提高患者的生存[17]。研究所有患者在手术切除之后均进行了预防性放疗，那么FOXM1极有可能是通过对放射治疗效果的影响，从而影响患者术后生存期的。

综上所述，在临床上可通过基因疗法对FOXM1进行干预，在行食管癌手术切除术之前，降低患者FOXM1基因表达量，从而增强食管鳞癌对放射的敏感性，达到控制病灶转移、提高患者术后手术切除率的目的。也可以通过对食管癌病理组织FOXM1蛋白表达量的高低判断，为食管癌患者术后预防性治疗提供相关理论依据，并可以将其作为判断预后的一个重要指针，通过加强对高表达患者的术后监测，采取相应的措施，提高患者的术后生存期。因此，FOXM1有望成为食管鳞癌的治疗靶点。

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Expression of FOXM1 and its effects on radiation sensitivity in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)

LIU Langhuan1,2LUO Aiwu1CHEN Keliang1GU Mengmeng2
XIAO Beibei2ZOU Shitao3HE Chao3ZHOU Jundong3HUANG Bo1
1(School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001, China)
2(School of Radiation Medicine and Protection, Medical College of Soochow University, Suzhou 215123, China)
3(Nanjing Medical University Affiliated Suzhou Hospital, Suzhou 215001, China)

Real-time PCR was used to examine the expression of FOXM1 (Forkhead box M1) in 40 esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) tissues, and the adjacent normal tissues. Immunohistochemistry was used toexamine the expression of FOXM1 protein in 94 ESCC tissues, and to analyze the relationship between ESCC and clinic pathologic. A small interfering RNA targeting FOXM1 was designed to silence the endogenous FOXM1 expression of ECA-109 and TE-1 cells. The effect of FOXM1 on radiation sensitive in esophageal squamous cell was observed by immunofluorescence stain, and colony formation assay. The results showed that FOXM1 mRNA expression level in esophageal cancer tissues was significantly higher than that of the adjacent tissues (p<0.01), and the protein level expression of it has negative correlation with the survival times; the designed siRNA could dramatically silence FOXM1 expression in ECA-109 cells; γH2AX focus induced by X-rays in FOXM1 silent cells was significantly higher than that in control cells; the clone formation ability of the silent FOXM1 group was significantly lower than that in the control group. The content of FOXM1 is improved in ESCC, and is negatively correlated with the prognosis of patients; the cell radiation sensitive proliferation is significantly improved in the silent FOXM1 ECA-109 cells. In conclusion, FOXM1 has the potential to be the treatment of esophageal squamous carcinoma target.

Esophageal squamous cell carcinoma, FOXM1 poor prognosis, Radiation sensitivity, DNA damage repair

LIU Langhuan (female) was born in May 1987 and graduated from Hunan Normal University Medical College in June 2010. Now she is a master candidate in University of South China majoring in radiation protection agent as a doctor.

PH.D. HUANG Bo, assosiate professer, E-mail: huangbo930@163.com

TL71

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.060202

湖南省自然科学基金项目(2016JJ2115)、南华大学博士启动基金(2015XQD31)、湖南省卫生计生委科研计划课题项目(C2015-17)资助

刘琅嬛，女，1987年5月出生，2010年6月毕业于湖南师范大学医学院，现为南华大学在读硕士研究生，研究方向为辐射防护剂研究，医师

黄波，博士，副教授，E-mail: huangbo930@163.com

初稿2016-09-01；修回2016-10-30

Supported by the National Natural Science Foundation of Hunan Province (2016JJ2115), Doctor stand-up foundation of University of South China (2015XQD31), Health and Family Planning Commission Scientific Research of Hunan Province (C2015-17)

Received 1 September 2016; accepted 30 October 2016

CLCTL71