海藻糖合成酶基因工程菌玉米浆培养基配方优化

姜 博

谢 定1

郑瑞娜1ZHENG Rui-na1

杨倩园1

谢艳萍2

盛 敏2

(1. 长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114；2. 湖南汇升生物科技有限公司，湖南 耒阳 421800)



海藻糖合成酶基因工程菌玉米浆培养基配方优化

姜 博1

谢 定1

郑瑞娜1ZHENGRui-na1

杨倩园1

谢艳萍2

盛 敏2

(1. 长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114；2. 湖南汇升生物科技有限公司，湖南 耒阳 421800)

以玉米浆作为重组大肠杆菌培养基的主要碳源和氮源，在单因素优化的基础上，选择玉米浆、MgSO4和微量元素3个因素对玉米浆培养基进行响应面设计，采用Box-Behnken试验设计和响应面分析法，确定基因工程菌最佳的玉米浆培养基配方。结果表明，最佳的玉米浆培养基配方为：玉米浆26 g/L，MgSO42.1 g/L，微量元素7 mL/L。该条件下，重组大肠杆菌产海藻糖合成酶酶活达到120.5 U/mL。试验证明了玉米浆作为重组大肠杆菌培养基唯一的碳源和氮源生产海藻糖合成酶的可行性。

玉米浆；海藻糖合成酶；重组大肠杆菌；培养基

海藻糖是由两分子葡萄糖通过α，α-1，1糖苷键构成的一种非还原性二糖[1]。化学性质非常稳定，高温下不会发生美拉德褐变[2]。不仅如此，海藻糖在生物体内既可以作为结构成分，又能提供能量，是良好的应激代谢产物，以其优良的抗逆保护作用而备受瞩目[3-4]。

海藻糖的生产方法有天然生物提取法、微生物发酵法、化学合成法、转基因法和酶转化法5大类[5]。其中酶转化法合成海藻糖以淀粉、葡萄糖或麦芽糖等碳水化合物为底物，能有效降低生产成本，易于工业化生产而被广泛关注。

利用重组大肠杆菌生产海藻糖合成酶，培养基的配方是影响成本的关键因素。目前，海藻糖合成酶基因工程菌多用酵母粉、甘油作为氮源，而工业级的酵母浸粉平均价格在4万/t，成本较高。中国玉米种植面积排世界第二，玉米淀粉是玉米深加工的主要产品[6]。玉米浸泡水的量约是淀粉生产量的1.5倍，玉米浆就是将玉米浸泡水浓缩到固形物含量在50%～70%的产物，是玉米淀粉加工过程中的副产物[7]。中国玉米淀粉年产量约1 200万t[8]。目前玉米浆的市场价格在1 000～3 000元/t，成本低廉，来源广泛[9]。玉米浆中含有较多的蛋白质、氨基酸、无机盐和糖类等，营养丰富，已有青霉素的大规模生产用玉米浆作为培养基的报道[10]，但尚未见其用于海藻糖合成酶相关菌发酵培养的报道。

本研究以玉米浆为培养基的主要成分，通过单因素试验和响应面试验对海藻糖合成酶基因工程菌玉米浆培养基进行优化研究，尝试用廉价的玉米浆替代酵母粉、甘油等成本较高的培养基成分进行海藻糖合成酶生产，旨在为工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种

海藻糖合成酶基因工程菌pET28(+)-BL21(DE3)：由本实验室构建和保藏；

Top10质粒：含有灰色链霉菌海藻糖合成酶基因，长沙金斯瑞生物公司。

1.1.2 原料和培养基

玉米浆(干)：总氮含量5.3%，华北制药康欣有限公司；

种子培养基(LB培养基)：胰蛋白胨 10 g/L、氯化钠 5 g/L、葡萄糖 1 g/L、酵母粉5 g/L，pH=7.0；

玉米浆发酵培养基：玉米浆 25 g/L、MgSO42.0 g/L、微量元素6.0 mL/L；

微量元素：FeSO4·7H2O 10 g/L、CuSO4·5H2O 1.0 g/L、MnSO4·4H2O 0.5 g/L、ZnSO4·7H2O 2.25 g/L、Na2B4O7·10H2O 0.23 g/L、CaCl22 g/L、(NH4)6Mo7O240.1 g/L 用5 mol/L浓盐酸溶解并储存于棕色试剂瓶中;

胰蛋白胨、酵母粉：生化试剂，广东环凯微生物科技有限公司；

其他化学试剂均为国药分析纯。

1.1.3 主要仪器和设备

超声波细胞粉碎机：SCIENTZ-ⅡD型，宁波新芝生物科技有限公司；

高效液相色谱仪：LC-20AD型(RID-20A示差折光检测器)，岛津制作所；

电子天平：FA1004型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制备 冷冻保藏的菌种经斜面活化后接入50 mL(含有终浓度为50 mmol/L的卡拉霉素)的种子培养基中，37 ℃，200 r/min震荡培养12 h，然后按5%的接种量接入100 mL(含有终浓度为50 mmol/L的卡拉霉素)的玉米浆培养基中，继续震荡培养至OD600约为0.6时加入终浓度为0.5 mmol/L的乳糖作为诱导剂，在25 ℃，200 r/min诱导20 h。取发酵液8 000 r/min离心10 min，用pH=7.5的磷酸缓冲液洗涤两次后重悬，冰浴超声，超声工作条件：功率300 W，工作3 s，间隔5 s，时间30 min。超声破碎后8 000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液。

1.2.2 酶活测定方法 粗酶液按体积比1∶20加入到10%用pH=7.5磷酸缓冲液配制的麦芽糖溶液中，35 ℃反应30 min后沸水浴灭酶5 min，离心取上清液用HPLC法检测海藻糖含量。

酶活力单位定义：上述反应条件下每分钟生成1 μmol海藻糖所需的酶量定义为1 U。

色谱条件：氨基柱(Agela Innoval NH2，5 μm，4.6×250 mm)；流动相：乙腈/水=80/20(体积比)；流速：1.0 mL/min；检测器：视差折光检测器；进样量：10 μL；检测池温度：35 ℃。

1.2.3 玉米浆发酵培养基的优化

(1) 玉米浆浓度对海藻糖合成酶酶活的影响：在培养基其他条件不变的情况下设置不同的玉米浆浓度(5，10，15，20，25，30 g/L)37 ℃、200 r/min培养至OD600约为0.6后加入乳糖诱导剂25 ℃，200 r/min诱导20 h制得粗酶液，然后测定酶活力。

(2) MgSO4浓度对海藻糖合成酶酶活的影响：在培养基其他条件不变的情况下设置不同的MgSO4浓度梯度(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g/L)37 ℃、200 r/min 培养至OD600约为0.6后加入乳糖诱导剂25 ℃，200 r/min诱导20 h制得粗酶液，然后测定酶活力。

(3) 微量元素浓度对海藻糖合成酶酶活的影响：在培养基其他条件不变的情况下设置不同的微量元素浓度梯度(2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0 mL/L)37 ℃、200 r/min 培养至OD600约为0.6后加入乳糖诱导剂25 ℃，200 r/min诱导20 h制得粗酶液，然后测定酶活力。

(4) 响应面优化培养基：在单因素的基础上确定玉米浆、MgSO4和微量元素的最佳浓度，然后通过响应面设计对最佳培养基成分进行优化以获得最佳配比。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

“不以规矩，不成方圆”。这句古语很好地诠释了规章制度的重要性。全面预算管理可以把“触角”延伸到高校医院各个部门的经济活动，必须有完善的规章制度保证。强化预算的执行是实现全面预算管理的关键，而强化预算的执行，必须以落实相应的管理制度作为强有力的保障条件，例如编制高校医院预算管理章程等，配备好相应的软硬件设备等。健全的全面预算管理制度是高校医院完善内部控制制度的集中体现，是高校医院走向精细化管理的强力“助推器”。

由图1～3可知，海藻糖合成酶酶活最高的培养基单因素组成和浓度为玉米浆25 g/L、MgSO42.0 g/L、微量元素6.0 mL/L。

2.2 响应面优化玉米浆培养基

在单因素的基础上根据Box-Behnken设计原理，以海藻糖合成酶酶活为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件设计三因素三水平试验，共有15个试验点，其中析因点有12个，零点有3个以估计误差。因素水平见表1，试验设计方案与响应值结果见表2。

图1 玉米浆浓度对海藻糖合成酶酶活的影响Figure 1 Effects of corn steep liquor concentrations on trehalose synthase activity

图2 MgSO4浓度对海藻糖合成酶酶活的影响Figure 2 Effects of MgSO4 concentrations on trehalose synthase activity

图3 微量元素浓度对海藻糖合成酶酶活的影响Figure 3 Effects of trace elements concentrations on trehalose synthase activity表1 Box-Behnken 因素水平Table 1 Box-Behnken factors and levels

水平A玉米浆/(g·L-1)BMgSO4/(g·L-1)C微量元素/(mL·L-1)-1201.54.00252.06.01302.58.0

表2 Box-Behnken 设计方案及响应值结果Table 2 Box-Behnken design and response results

2.2.1 响应面方差分析 利用 Design-Expert 8.0.6 对试验结果进行二次多元回归拟合，对表2中的数据进行方差分析后得到模型的二次多项回归方程为：

Y=120.00+5.07A+5.75B+3.43C-2.57AB-1.08AC-1.22BC-11.59A2-16.99B2-4.29C2。

(1)

对此模型进行方差分析见表3。

由表3可知，模型的P值为0.000 1<0.01，而失拟项P=0.341 6>0.05，说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占的比例小，表明响应值Y与回归方程的关系是极显著的。从表3中还可以看出在此模型中A、B、C、AB、A2、B2、C2均显著，AC、BC不显著。

表3 回归模型方差分析†Table 3 Analysis of Variance in Regression Model

† **表示差异极显著，P<0.01；*表示差异显著，P<0.05；-表示差异不显著，P>0.05。

经手动优化后的回归方程为：

Y=120.00+5.07A+5.75B+3.43C-2.57AB-11.59A2-16.99B2-4.29C2。

(2)

由表4可知，失拟项不显著(P=0.338 7>0.05)，而模型的P值<0.000 1，表明模型高度显著；同时软件的复相关系数R的R2=0.986 4，校正后的R2(adj)=0.972 8，这表明该模型拟合程度良好，试验误差小，该模型可以对发酵产海藻糖合成酶进行分析和预测；从上面的结果可以看到，玉米浆、MgSO4和微量元素均是生产海藻糖合成酶的关键因素，其中玉米浆和MgSO4有较大程度的相互作用，在所选因素水平范围内，各因素对酶活影响的主次顺序为：MgSO4>玉米浆>微量元素。

表4 去掉交互项AC和BC后的优化结果†Table 4 Optimization results after removal of AC and BC

† **表示差异极显著，P<0.01；*表示差异显著，P<0.05。

图4为AB因素的三维响应曲面图和等高线图。由图4可知，在微量元素一定时，酶活随着玉米浆和MgSO4浓度的增加都是先增后减，可以看出玉米浆和MgSO4的交互作用比较显著，这与表4的结果一致。从AB两因素的响应面等高线图可知，最大椭圆表示在该圆上取值，酶活最低，产量最小；而最小椭圆取值，酶活最高，产量最大。大小椭圆之间酶活逐渐递进。

图4 玉米浆和MgSO4对海藻糖合成酶活的影响Figure 4 Effects of corn steep liquor and MgSO4 on trehalose synthase activity

2.2.3 最佳条件的预测和验证 通过Design-Expert 8.0.6软件对经手动优化的二次回归方程求解。响应值Y物理意义是海藻糖合成酶酶活，因而优化标准设置为最大值，同时设置上限(响应值的上限设置为不可能达到的数值用来确定最佳响应值点，此次试验响应值最大上限设)为200(200近似为麦芽糖完全转化为海藻糖的理论极限酶活)，得到最优培养基配方只有一种：玉米浆26.01 g/L，MgSO42.08 g/L，微量元素6.80 mL/L。预测酶活达到121.6 U/mL。考虑到实际操作的可行性，对配方进行取整验证，玉米浆26 g/L，MgSO42.1 g/L，微量元素7 mL/L在此条件下进行3次验证性实验，测得海藻糖合成酶酶活平均值为120.5 U/mL，与理论值基本吻合，因此该模型可以较好地预测实际培养情况。

3 结论

试验证明，Box-Behnken设计法能有效地筛选出重要影响因素并实现条件优化。经上述方法优化，产海藻糖合成酶的玉米浆培养基配方为：玉米浆26 g/L，MgSO42.1 g/L，微量元素7 mL/L。用最佳培养基配方培养重组大肠杆菌产海藻糖合成酶酶活力为120.5 U/mL，与响应面分析值接近。由此可见，使用玉米浆作为重组大肠杆菌产海藻糖合成酶的培养基唯一碳源和氮源是可行的，而且玉米浆成本低廉，这就为使用玉米浆培养基进行大规模发酵提供了依据。

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Optimization ofcorn steep liquor medium for trehalose synthase gene engineering bacteria by response surface methodology

JIANG Bo1

XIEDing1

YANGQian-yuan1

XIEYan-ping2

SHENGMing2

(1.CollegeofChemistryandBioengineering,ChangshaUniversityofScienceandTechnology,Changsha,Hunan410114,China; 2.HunanHuishengBio-TechnologyCo.Ltd,Leiyang,Hunan421800,China)

Corn steep liquor was used as the sole carbon and nitrogen source for recombinantE.coliculture medium. Based on the single factor optimization, three factors of corn steep liquor, MgSO4and trace elements were chosen to design the response surface of corn steep liquor medium components. With Box-Behnhen experimental design and response surface analysis, the optimum components of corn steep liquor medium were determined. The results showed that the optimum medium components were 26 g/L for corn steep liquor, 2.1 g/L for MgSO4and 7 mL/L for trace elements. Under these conditions, the activity of trehalose synthase produced by recombinantE.colireached 120.5 U / mL. The experiment proved that this medium is feasible, in which corn steep liquor was the sole carbon and nitrogen source of trehalose synthase.

corn steep liquor; trehalose synthase; recombinantE.coli; medium

湖南省自然科学基金(编号：2015JJ2010)；衡阳市创新创业人才团队计划(编号：2016)

姜博，男，长沙理工大学在读硕士研究生。

谢定(1962-)，男，长沙理工大学教授，博士。 E-mail:cslg5148495@126.com

2016—09—24

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.042