骨髓源性脂肪祖细胞培养及生物学特性研究

朱光旭，王金祥，周 芳，李自安，刘菊芬，阮光萍，白盈盈，潘兴华

骨髓源性脂肪祖细胞培养及生物学特性研究

朱光旭，王金祥，周 芳，李自安，刘菊芬，阮光萍，白盈盈，潘兴华

目的体外培养骨髓脂肪祖细胞（BMAPs），比较其与骨髓间充质干细胞（BMSCs）在形态、表型特征、成脂肪分化能力以及脂肪分化相关基因表达方面的差异。方法无菌取1～2月龄雄性SD大鼠的股骨和胫骨骨髓制作细胞悬液，EBM-2 (含20%FBS、15 μg/ml ECGs)培养基差速贴壁法培养第3次贴壁细胞，取传代至第3～5代细胞用于实验。流式细胞分析检测CD34、CD44、CD45及CD90表达；STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit检测细胞成脂肪分化能力；实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)检测过氧化物酶体增殖激活受体γ（Ppaγ）、脂肪酸结合蛋白4（Fabp4）、脂蛋白脂肪酶（Lpl)、CCAAT/增强子结合蛋白α（Cebpa）、葡萄糖转运蛋白4（Slc2a4）及前脂肪细胞因子1（pread1）mRNA表达水平。结果传代接种培养24 h后，BMSCs形态上呈宽大、扁平状，而BMAPs大部呈长三角状；接种48 h后，BMSCs排列更为有序，而BMAPs多交织成网状。BMAP表达CD34、CD44、CD45及CD90，BMSC表达CD44及CD90，未检测到CD34和CD45表达。诱导培养后第4 d，BMAPs成脂率显著高于BMSCs（P＜0.01）；到第8 d，BMAPs成脂率为（87.2±11.67）%，BMSCs成脂率为（18.5±10.2）%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。诱导分化后第4、8 d，Cebpa、Fabp4、Lp1、Ppaγ和Slc2a4 mRNA在BMAPs表达水平均显著高于BMSCs（P＜0.01）。结论本实验获得了1种具有干细胞的生物学特性，高表达脂肪分化相关的特异性基因，可高效均质性地分化为脂肪细胞的BMAPs。

骨髓；脂肪祖细胞；间充质干细胞；脂肪细胞；分化

骨质疏松症患者往往伴随了骨髓肥胖，而骨髓脂肪细胞的生成造成的骨髓脂肪堆积是促进骨髓疏松症发病进程的关键[1]。骨髓间充质干细胞（BMSCs）可以向脂肪细胞分化，但其成脂肪分化能力并不一致。文献报道，人原代培养的BMSC在体外诱导时，绝大部分细胞并不能分化为脂肪细胞[2]，因此，骨髓内可能存在其他具有脂肪细胞分化潜能的细胞。在正常骨髓，随着年龄的增长，相当一部分红骨髓会被黄骨髓取代，而黄骨髓内主要包含大量脂肪细胞，因此，研究骨髓脂肪堆积和骨髓细胞脂肪分化及其机制有重要的潜在医学价值。骨髓内主要包含造血干细胞和基质细胞两种类型的干细胞[3]，二者均具有多向分化潜能，造血干细胞在适当培养条件下可被诱导分化为内皮祖细胞[4]，骨髓内干细胞是否也可以被诱导培养分化为脂肪祖细胞(BMAPs)，未见研究报道。本实验应用内皮基础培养基-2（EBM-2）联合内皮生长因子添加剂（ECGs），在含20%胎牛血清条件下，差速贴壁法去除BMSCs与其他类型单个核细胞后，培养出一类具备较强的成脂肪分化能力和一定成骨分化能力的细胞。

1 材料与方法

1.1 实验材料 1～2月龄雄性SD大鼠由昆明医科大学实验动物中心提供，动物实验经伦理委员会批准。DMEM/F12干粉培养基（Hyclone公司），优质胎牛血清 （FBS，PAA公司），GoScript反转录系统、逆转录聚合酶链式反应 （RT-PCR）marker、GoTaqqPCRMaster M iX（Progema公司），STEMPROOsteogenesis Differentiation Kit(Gibco)，STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit(Gibco)，内皮基础培养基-2（EBM-2，Lonza），内皮生长因子添加剂（ECGs, Millipore），PE-抗大鼠CD34(abcam)，FITC-抗大鼠CD45(ebioscience)，PE-抗大鼠 CD44(ebioscience)，FITC-抗大鼠CD90 (ebioscience)，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma)，实时定量PCR仪以及凝胶扫描仪（Bio-RAD）,FT-6000酶标仪(RAYTO公司)，流式细胞分析仪(FACScan,Becton Dickinson)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 脱臼处死SD大鼠，无菌取股骨和胫骨,PBS冲洗骨髓入无菌培养皿，轻轻吹打使细胞分散，将细胞悬液转移到离心管，静置8～10 min，使组织块沉降到管底，转移细胞悬液到另一离心管，1500 r/m离心5 min弃上清，以EBM-2(含20%FBS、15 μg/ml ECGs及青、链霉素各100 U/ml)培养基小心吹打混匀，以1×107/cm2接种于培养瓶，37℃、5%CO2条件下培养。24 h后弃贴壁细胞，转移细胞悬液到另一培养瓶，再次孵育24 h后弃贴壁细胞，转移细胞悬液到另一新培养瓶继续培养；48 h后再次弃悬浮细胞，对第3次贴壁细胞进行培养，以后每4 d换一次液，待细胞铺满瓶底约80%～90%后，进行传代培养，取第3～5代细胞用于实验。

1.2.2 流式细胞分析 取P4细胞制作细胞悬液，取3×105细胞与含1～2%的牛血清白蛋白和0.1%叠氮钠的冷PBS稀释的相应抗体在4℃孵育45 min，以PBS或同型抗体为对照，孵育完毕后加入冷PBS 1 ml，离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。加入冷PBS 500 μl，吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存、待测。对非直接荧光标记抗体，用含1%～2%的牛血清白蛋白和0.1%叠氮钠的冷PBS稀释第1抗体，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1.5 h；离心弃上清，加入含1%～2%的牛血清白蛋白和0.1%叠氮钠的冷PBS稀释第2抗体，4℃或置冰上孵育避光30 min；将细胞重新悬浮于500 μl PBS中混匀，置流式管中，4℃冰箱避光保存，流式细胞分析仪进行检测。

1.2.3 成脂、成骨分化实验 成脂诱导：消化收集P4代细胞，按照1×104个/cm2接种到12孔板中静置培养，至细胞100%甚至是过度融合时，弃培养液，加入成脂分化诱导液培养，每隔3 d换液。诱导培养14 d后，用4%多聚甲醛固定细胞，进行油红O染色。采用DAPI标记细胞核，检测DAPI阳性细胞数，同一视野下观察脂肪细胞分布及数量，计算公式为：脂肪细胞百分率=（油红O染色阳性细胞数÷细胞总数)×100%。成骨诱导：将P4代细胞按照5× 103/cm2接种到12孔板中静置培养，至细胞60%融合状态时，弃培养液，加入成骨诱导液连续培养，每隔3 d换液，培养21 d后，用4%多聚甲醛固定细胞，加入茜素红进行染色。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应检测基因表达 按照GoScript反转录试剂说明，取细胞进行mRNA提取并进行反转录，获得cDNA。所获得的cDNA用GoTaqqPCRMaster MiX，按照操作说明进行实时定量PCR测定。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作内参照。反应条件为50℃2 min，95℃变性10 min→95℃15 s→55℃退火1 min→72℃延伸30 s,循环次数35次，溶解曲线65～55℃，增量0.5℃5 s。反应结束后各取PCR产物4 μl，进行1.7%琼脂糖电泳，用Gel Doc 2000凝胶图像扫描仪分析。所需PCR引物应用Primer3web version 4.0.0（http://primer3.ut.ee/）设计（表1）。

表1 实时定量聚合酶链式反应引物

2 结果

2.1 培养细胞的生长特征与成骨及成脂肪分化

由于BMSCs同样具有成脂肪分化能力，因此以BMSCs为对比进行分析。接种后24 h，BMSCs形态上呈宽大、扁平状(图1D），第三次贴壁细胞(BMAPs)大部呈三角状 (图1A)；接种后培养48 h，相较于BMAPs，BMSCs排列更为有序(图1E)，前者多交织成网状(图1B)；在融合生长期，BMSCs的有序排列状况(图1F)较BMAPs(图1C)更为明显，呈漩涡式生长。成骨分化实验表明，BMSCs和BMAPs均能够被诱导向成骨细胞（图1G和H）和脂肪细胞(图1I和J）分化。

2.2 BMAPs和BMSCs的表面标志表达 流式细胞分析表明BMAPs表达CD34、CD44、CD45及CD90等表面标志，其中CD34表达率为（86.6±6.7）%，CD44表达率为 （92.1±7.9）%，CD45表达率为 （88.4±3.6）%，CD90表达率为（81.3±7.8）%。BMSCs主要表达CD44以及CD90，未检测到CD34和CD45表达，其中CD44表达率为（88.1±3.1）%，CD90表达率为（73.4±6.2）%。见图2。

2.3 BMAPs与BMSCs脂肪细胞分化能力的比较

BMAPs与BMSCs均可以被诱导分化为脂肪细胞，但是二者向脂肪细胞分化能力有显著区别（图3）。诱导培养后第4、8 d，BMAPs成脂率为（47.6±4.7）%，显著高于BMSCs组的（4.4±3.2）%（P＜0.01）；到第8 d，BMAPs成脂率为（87.2±11.67）%，同样显著高于BMSCs组的（18.5±10.2）%（P＜0.01）。见图3。

2.4 脂肪相关基因在BMAPs与BMSCs成脂肪分化诱导中的表达变化 Ppaγ、Fabp4、Lpl、Cebpa、Slc2a4及 pread1等 6种脂肪分化标志基因在BMAPs呈不同程度表达 （图4A），real-time PCR检测结果表明，除了 pread1外，Cebpa、Fabp4、Lp1、Ppaγ和Slc2a4总体上在BMSCs和BMAPs的表达，均随脂肪诱导分化而升高，而pread1随脂肪诱导分化而降低；到诱导分化后第4、8 d，Cebpa、Fabp4、Lp1、Ppaγ和 Slc2a4在BMAPs表达均显著高于在BMSCs的表达（P＜0.01），即使在未进行诱导分化前，Cebpa、Ppaγ和Fabp4、特别是Fabp4在BMAPs的表达也显著高于在BMSCs表达（P＜0.01）。

3 讨论

新近研究证实，骨髓来源干细胞参与了哺乳动物的脂肪生成[6]，骨髓可以被看作为BMAPs的储存库[6]，但骨髓内是否存在BMAPs的研究较少。BMSCs已被证实可以向脂肪细胞分化，但人原代培养BMSCs在体外诱导时绝大部分细胞并不能分化为脂肪细胞[2]，因此，很难把BMSCs等同于BMAPs。Lu等[5]应用免疫磁珠从 BMSCs分离获得的 Sca-1+、CD73-、CD90-、CD105+细胞亚群具有极强的成脂肪分化能力，且命名为BMAPs，但该亚群细胞仅占BMSCs微小部分。

本实验应用EBM-2培养基联合ECGs，在含20%FBS条件下，培养第三次贴壁的骨髓单个核细胞，理论上排除了BMSCs和其他类型单个核细胞污染。与BMSCs比较，培养细胞形态上略有区别，接种培养24 h后，该细胞大部分呈三角状，而BMSCs呈宽大、扁平状。培养48 h后，BMSCs排列更为有序，前者多交织成网状；在融合生长期，BMSCs的有序排列状况更为明显，呈漩涡式生长。成骨分化实验表明，二者均具有向成骨细胞分化能力，但诱导培养后第4 d，该细胞成脂率显著高于BMSCs组，到第8 d该细胞成脂率高达为（87.2±11.67）%，而BMSCs组仅为（18.5±10.2）%。由于具有极高的成脂肪细胞分化能力，并且具有干细胞多向分化特性，表明该细胞具有BMAPs属性。

图1 培养BMAPs和BMSCs的生长特征及成骨、成脂分化

图2 BMAPs和BMSCs的表型分析结果

图3 BMAPs与BMSCs向脂肪细胞分化能力

图4 脂肪相关基因在BMAPs和BMSCS成脂分化过程中的表达变化

流式细胞分析表明，BMAPs表达CD34、CD44、CD45以及CD90等表面标志，其中CD34表达率高达为（86.6±6.7）%。在骨髓，CD34是HSCs的主要标志，表明该细胞应由HSCs分化而来；CD45表达率为（88.4±3.6）%。BMSCs主要表达CD44以及CD90，未检测到CD34和CD45表达。Ppaγ[7-8]、Cebpa和Fabp4[5,9]以及Slc2a4[10]是脂肪分化相关特异性转录因子，在脂肪生成的调节中起关键作用。Ppaγ、Cebpa和Fabp4在脂肪分化早期即有表达,且它还可调控其他脂肪细胞特异性基因的表达,从而调控成脂肪分化。通过RT-PCR技术检测这些相关基因的表达，结果表明包括 pread1、Ppaγ、Cebpa和Fabp4，在BMAPs表达的水平均显著高于在BMSCs表达；Ppaγ、Cebpa、Fabp4、Lp1和 Slc2a4均随细胞脂肪分化而显著上升，BMAPs各组的表达水平均显著高于在BMSCs表达，而pread1则随成脂肪细胞诱导分化而显著降低，特别是诱导后第8 d，pread1在BMAPs表达水平显著低于其在BMSCs的表达。

本实验所获得的细胞具有成骨和成脂肪分化潜力，具有干细胞的生物学特性，同时高表达脂肪分化相关的特异性基因，可高效均质性地分化为脂肪细胞，可定义为BMAPs，结果为肥胖以及脂肪组织增生的研究提供了新的理论基础和细胞模型。

[1] Rosen CJ,Ackert-Bicknel C,Rodriguez JP,et al.Marrow fat and the bone microenvironment:developmental,functional,and pathological implications[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr,2009, 19(2):109-124.

[2] Russel KC,DG Phinney,MR Lacey,et al.In vitro high capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitmen[J].Stem Cells,2010,28:788-798.

[3] Oswald J,Boxberger S,Jθrgensen B,et al.Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro[J].Stem Cells,2004,22(3):377-384.

[4] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997, 275(5302):964-967.

[5] Lu Q,Liu H,Cao T.Efficient isolation of bone marrow adipocyte progenitors by silica microbeads incubation[J].Stem Cells Dev, 2013,22(18):2520-2531.

[6] Rydén M,Uzunel M,Hãrd JL,et al.Transplanted bone marrow-derived cells contribute to human adipogenesis[J].Cell Metab,2015,22(3):408-417.

[7] 张艳,刘友学.脂肪细胞分化过程中的分子事件 [J].儿科药学杂志,2008,14(1):56-57.

[8] 高宇，余庆雄，李青峰.脂肪干细胞体外诱导分化的研究进展[J].组织工程与重建外科杂志,2014,10(2):106-108.

[9] Gao Y,Sun Y,Duan K,et al.CpG site DNA methylation of the CCAAT/enhancer-binding protein,alpha promoter in chicken lines divergently selected for fatness[J].Anim Genet,2015,46(4): 410-417.

[10] Lee N,Kim I,Park S,et al.Creatine inhibits adipogenesis by downregulating insulin-induced activation of the phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway[J].Stem Cells Dev,2015,24(8):983-994.

Study on culture and biological characteristics of BMAPCs

Zhu Guangxu1,Wang Jinxiang1,Zhou Fang1,2,Li Zi'an1,Liu Jufen1,Ruan Guangping1,Bai Yingying1,2,Pan Xinghua11.Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032, China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032, China;2.Clinical College of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming Medical University,Kunming, Yunnan,650032,China

Objective To explore the difference in morphology,phenotypic characteristics,capacity to differentiate into fat cells and expressions of genes relevant to differentiation into fat cells between bone marrow adipocyte progenitor cells(BMAPCs)and bone mesenchymal stem cells(BMSCs).MethodsThe femoral and tibial bone marrow of male SD rats aged one to two months was sampled in a sterile manner to prepare cell suspension.The third adherent cells were cultivated by differential adhesion method in EBM-2 (containing 20%FBS,15 μg/m l ECGs)culture media.Passage three(P3)-passage five(P5)of the third adherent cells were used in the experiments.The expressions of CD34,CD44,CD45 and CD90 were detected by flow cytometry;the capacity of cells to differentiate into fat cells was detected by STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit.The levels of Ppaγ,Fabp4,Lpl,CCAAT/enhancer binding protein α(Cebpa),glucose transporter(GLUT)4(Slc2a4)and pread1 mRNA were detected by real-time qPCR.Results24 hours after the passage inoculation culture,BMSCs were wide and flat in morphology,while the most of BMAPCs were in long triangle shape.48 hours after the inoculation,the arrangement of BMSCs was more orderly,while most BMAPCs were interwoven into a network.BMAPCs expressed CD34,CD44,CD45 and CD90;BMSCs expressed CD44 and CD90,CD34 and CD45 were not expressed.On the fourth day after the induction culture,the fat cell percentage of BMAPCs was significantly higher than that of BMSCs(P＜0.01);on the eighth day,the fat cell percentage of BMAPCs was(87.2±11.67)%,while that of BMSCs was(18.5±10.2)%, showing a more significantly difference(P＜0.01).On the fourth and eighth day after the induction differentiation,the levels of Cebpa, Fabp4,Lp1,Ppaγ and Slc2a4 mRNA in BMAPCs were significantly higher than those in BMSCs(P＜0.01).ConclusionOne kind of BMAPCs which have the biological characteristics of stem cells and high levels of distinctive genes relevant to differentiation into fat cells and can be effectively and homogenously differentiated into fat cells are obtained in the experiment.

BMAPC;MSC;fat cell;differentiation

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1386-06

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.010

2016-07-04）

国家科技支撑计划项目（2014BI01B00）；国家自然科学基金（81170316）；云南省科技计划项目（20111HB050，2013DA004）

650032昆明，成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室（朱光旭，王金祥，周 芳，李自安，刘菊芬，阮光萍，白盈盈，潘兴华）；昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院（周 芳，白盈盈）

潘兴华:E-mail:panxinghua@aliyun.com